葡萄座腔菌A13人工诱导对白木香叶化学组成影响研究

葡萄座腔菌A13人工诱导对白木香叶化学组成影响研究张道旭;冯美柔;陈晓东;陈晓颖;周欣;高晓霞
【摘要】分析了葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina)A13人工诱导对白木香叶化学组成的影响.以B.rhodina A13人工诱导前后白木香叶为材料,GC-MS联用技术分析白木香叶三氯甲烷提取物挥发性成分.研究发现,已结香、未结香白木香叶化学组成差异较大,十六烷酸、角鲨烯、β-谷甾醇、γ-谷甾醇和α-生育酚为差异组分.结果表明,B.rhodina A13人工诱导沉香(树脂)形成过程中,对白木香叶挥发性成分可产生一定影响.
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2017(045)002
【总页数】6页(P53-58)
【关键词】白木香叶;沉香形成;葡萄座腔菌A13
【作者】张道旭;冯美柔;陈晓东;陈晓颖;周欣;高晓霞
【作者单位】广东药科大学药学院, 广东广州 510006;哈药集团技术中心, 黑龙江哈尔滨 150025;广东药科大学药学院, 广东广州 510006;广东药科大学药学院, 广东广州 510006;仙乐健康科技股份有限公司, 广东汕头 515041;广东药科大学药学院, 广东广州 510006;广东药科大学药学院, 广东广州 510006;广东药科大学药学院, 广东广州 510006
【正文语种】中文
【中图分类】R917
白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg)是双子叶植物瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)的乔木植物，又名土沉香、牙香树、女儿香、莞香树、崖香树、青桂香等，属国家二级濒危保护植物，也是《世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》(IUCN Red List of Threatened Plants)和《濒危野生动植物种国际贸易条约CITES》保护植物[1]，主要分布于我国海南、广东、广西、云南、台湾。

白木香是伤害诱导型植物，在自然条件下，受虫蚁蛀、雷劈、火烧、微生物侵染等自然刺激或损伤后，发生防御反应，在伤口及周围木质部产生树脂类物质填充心材，手工割取心材部位，即传统名贵药材和天然香料沉香[2]。

沉香性味辛、苦，温，具行气
止痛、温中止呕、纳气平喘之功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症[3]。

沉香的化学成分主要包括倍半萜、2-(2-苯乙基)色酮和芳香族类化合物[2]。

研究表明，白木香形成沉香与真菌代谢有关[4]。

课题组前期从白木香不同部位分
离到20多株内生真菌，进行人工诱导试验，结果表明不同真菌侵染均能诱导白木香形成沉香，但是结香效果差异极大。

其中，分离自白木香结香部位的内生真菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina A13，其无性型：Lasiodiplodia theobromae)促香效果较好，且产量较高[5-7]。

冯乃宪[8]、魏建和[9]、郭顺星[10]和韩晓敏[11]等均报道葡萄座腔菌是一种产沉香诱导剂。

白木香结香周期长，沉香药材价值高且稀缺。

叶为白木香的非传统药用部分，民间常用于治疗炎症及过敏症。

研究表明，白木香叶主要含有挥发油、黄酮及其苷类、酚类、三萜类、鞣质、多糖、氨基酸等活性成分[12-13]，具有抗炎、镇痛、抗氧化、降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种药理活性[14-17]。

白木香叶资源十分丰富且
产量大，每年可采2～3季，已有大型种植企业开发出具有助睡眠、消胀气和排宿便等作用的沉香茶[18]，开发前景十分广阔。

目前鲜有白木香形成沉香(树脂)过程中，白木香叶中化学组成动态变化规律研究报道，因此现以B. rhodina A13人工
诱导白木香结香，动态采集结香过程中同一植株的叶片，对其化学组成动态变化进行分析，以期为白木香叶资源的综合开发利用提供基础数据。

白木香种植于广东省信宜市金垌镇，经广东药科大学中药学院严寒静副教授鉴定为白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg。

分别采集10月龄和6年龄白木香叶片后，6龄植株进行人工造香，该植株于人工诱导8、12、15和21个月采集叶片。

未结香的白木香主要判断的依据为：白木香种植于信宜市金垌镇，未进行人工造香试验，且未观察到虫蚁蛀的孔洞、倒伏等自然损伤和刺激的情况。

样品信息见表1。

人工造香方式为接种法人工诱导，接种菌株葡萄座腔菌Botryosphaeria rhodina A13由广东省微生物研究所章卫民研究员提供和鉴定。

人工诱导方法详见参考文
献[19]。

HP5890GC/HP5972MS气/质联用仪，美国惠普公司；HH-6数显电子恒温水浴锅，江苏金坛市宏华仪器厂；DL-360A超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；Varian CPsil 5 CB(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，美国Agilent
公司；三氯甲烷溶剂(AR)，广州化学试剂厂。

2.1 供试品溶液的制备
白木香叶片，阴干，粉碎(过60目筛)。

取白木香叶粉末2 g，精密称定，置具塞
锥形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL，密塞，摇匀，称定重量，冷浸24 h，超声
处理(功率600 W，频率40 kHz)30 min，放冷，称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解，转移至1 mL 量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件
色谱柱：Varian CPsil 5 CB(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气；升温程序：90 ℃保持4 min，1 ℃/min升至145 ℃，保持30 min，2 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，2 ℃/min升至
230 ℃，保持60 min；流速：1.0 mL/min；进样方式：不分流；进样量：1 μL。

2.3 质谱条件
离子源：EI；电离电压：70 eV；电离电压：1976 mV；离子源温度：171 ℃；溶剂延时：4 min；质谱扫描范围：50～550 m/z。

2.4 数据处理
通过HPMSD化学工作站，应用Wiley138质谱数据库进行检索鉴定，并采用峰
面积归一化法计算各样品化合物的相对百分含量。

将各样品化合物相对百分含量数据以csv格式导入R软件，运用gplots程序包对数据进行Heatmap分析，筛选差异组分。

3.1 GC-MS分析
采用峰面积归一化法计算各样品中挥发性成分的相对百分含量，结果见表2及图1。

6批白木香叶分别鉴定出17、18、20、30、31、6个化合物，已鉴定出化合物的总相对百分含量分别为52.609%、54.229%、39.374%、58.908%、62.735%、60.926%。

白木香叶主要成分有脂肪酸酯/脂肪烷类、芳香族类、萜类及甾醇类化
合物。

其中，未结香叶中脂肪酸酯/脂肪烷类化合物相对百分含量最高，分别为42.558%、30.196%，而已结香叶中肪酸酯/脂肪烷类化合物相对百分含量相对较低，分别为21.969%、15.674%、19.810%、0.127%；未结香叶中萜类化合物相对百分含量分别为7.321%、17.698%，已结香叶中萜类化合物相对百分含量分别为4.543%、16.985%、9.113%、19.395%；且与未结香叶相比，已结香叶中芳
香族类及甾醇类化合物相对百分含量相对较高。

3.2 差异组分分析
对已鉴定的挥发性成分使用R语言gplots程序包进行Heatmap分析，结果见图2。

其中，横坐标代表样品，纵坐标代表化合物，heatmap图中不同颜色代表各
化合物峰面积归一化相对百分比含量。

未结香1样品中21号化合物
(Hexadecanoic acid，十六烷酸)为差异组分，相对百分含量为17.630%；已结香12个月79号化合物(β-Sitosterol，β-谷甾醇)为差异组分，相对百分含量为19.556%；已结香15个月样品中80号化合物(γ-Sitosterol，γ-谷甾醇)为差异组分，相对百分含量为14.872%；已结香21个月样品中70号化合物(Squalene，角鲨烯)和86号化合物(α-Tocopherol，α-生育酚)为主要差异组分，相对百分含量分别为19.395%和20.451%。

3.3 讨论
沉香(树脂)形成周期长，难度大、效率低，且采收需“伐树取香”。

传统方法是砍下树干，手工割取心材的结香部位，仅从树干外观无法观察和判断其结香情况。

白木香叶资源丰富、四季可采集，分析白木香人工诱导过程中，白木香叶化学组成动态变化规律，在叶片中筛选出与沉香形成相关的标志物，通过检测叶片中结香标志物，判断树干中结香情况，可准确、无损地判断沉香采收期。

本研究表明，白木香叶三氯甲烷提取物的主要成分为脂肪酸/烷类、芳香族类、萜类和甾醇类化合物。

B. rhodina A13人工诱导过程中，白木香叶中脂肪酸/烷类化合物相对含量不断降低；甾醇类化合物相对含量先升高再降低，于12个月时达到最大值；人工诱导12个月开始检测到芳香族化合物，且在21个月时达到最大值。

其中，未结香叶中十六烷酸，已结香叶中β-谷甾醇、γ-谷甾醇、角鲨烯以及α-生育酚为主要差异组分，即在白木香形成沉香过程中动态变化最显著的成分。

课题组前期通过对未结香、不同方式造香的白木香叶中挥发性成分进行比较研究，发现角鲨烯、α-生育酚、9,12,15-十八烷三烯酸甲酯与沉香树脂形成相关，且α-生育酚仅在已结香的白木香叶中检测到[20]。

本文中B. rhodina A13人工诱导前期未检测到角鲨烯和α-生育酚，人工诱导12个月开始检测到二者并于21个月达到最大值，提示角鲨烯和α-生育酚可作为判断葡萄座腔菌人工诱导白木香结香情况的信号分子。

本研究利用GC-MS联用技术对来源于同一植株的白木香叶三氯甲烷提取物进行比
较分析，结果表明白木香结香与否对白木香叶化学组成影响较大，该结论对进一步合理开发利用白木香叶资源，探讨白木香叶化学组成与结香速度、结香质量之间的相关性提供基础数据。

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