facaria流式细胞仪操作程序

F A C A r i a流式细胞仪操作程
序(总3页)
-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除
一、准备工作
1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。

1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。

再用干棉签擦干。

2）5ml注射器吸超纯水，清洗缝隙。

用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。

2，鞘液桶加液
3，喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。

用滤纸吸干水分，晾干。

二、开机启动
1，启动电脑，密码BDIS，点开软件，无密码
2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。

3，液流启动：Cytometer----Fiuid Setup
1）气路（透明管）、液路（蓝色管），从乙醇桶上拔下，插到鞘液桶
2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置，旋转至12点方向
3）取下闭合喷嘴
4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。

4，喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---Sort Setup----70um（选择当前使用的喷嘴大小）5，液流调整：
点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。

查看是否都处于正常状态：
1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。

如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。

2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方
3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。

4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。

然后关闭主机箱外盖。

调整液流：通过调整振幅来实现。

1）振幅Ampl，数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。

2）频率Freg，一般不动。

3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。

100um时，为10,、11、12。

4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。

5）点击Stream Spot，锁死数值，保持液流稳定。

Drop1：实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。

Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。

此视为稳定液流。

三、手动调补偿：
样品：Negative（双阴管），FITC（单阳），PE（单阳），Sample（FITC,PE双阳）
1，Browser中：建立文件夹（单击folder图标）-----建立文件（单击experiments 图标），出现CST新窗口，选择keep current cytomoter setting-----建立样本，单击注射器图标，出现spcimen----点开下面的+号，出现Tube，点成绿色。

以上文件最好都改名，分别右击英文，raname。

2，Inspect 对话框中看参数，Cytometer中调参数。

在电压Parament中：FSC，SSC选择线性，即lingeage，即不打勾。

其他对数
log，即打勾。

3，Inspect中lables，改标签名称，egCD3-FITC,CD4-PE。

4，上ddH2O，Flow rate ：11。

5，上样品Negtive（双阴），Flow rate 只要在1/5 Fred （说明Fred单位为kHZ，所以乘以1000除以5）。

画散点图两个，分别选择标识。

图一：横坐标FSC，纵坐标SSC。

图二，横坐标
CD4-FITC，纵坐标CD8-PE。

图一，调节FSC，SSC的电压，在Cytometer中parameter里。

使得样品出现在中
央位置。

图二，调节FITC，PE的电压，使得散点落在左下侧里。

完成收样后，在图一画门。

在图二右击show population，点击P1，再右击show
population hierarchy显示门的关系，再十字象限画门。

6，上样品FITC单阳管。

调补偿。

在Acquisition Dashboard中选择next tube，在load样品。

不可选择new tube。

调补偿。

在PE-X%FITC。

X上调数字，使得散点图落下。

7，同理，上PE单阳。

如果双阴跑出横纵坐标以外，可以自动或者手动调整负轴。

Automatic 自动，则单击Inspector，选Pot Plot，在Biexponential Display
中把X Axis，Y Axis，打勾，使负值轴显示。

Manual 手动，打勾，调数值。

8，上双阳。

9，事后调补偿。

若复制到当前文件夹。

在Browser的当前tube中右击Cytometer，选择copy spectral overlap，选择Past spectral overlap在总experiment。

若复制到其他文件夹。

在Browser的experiment在右击Duplicate Without Data 四、自动补偿
1，在Browser中New experiment，选择keep current setting。

在Cytometer settings中删除参数。

2，文件栏中experiment，选compersation setup，选creat compensation controls。

将自动生成各种tube，点击tube呈绿色后，自行生成散点图和直方
图。

3，上样，双阴管。

调整电压FSC SSC电压，在Cytometer中的Parameter，使得细胞在中央位置。

上样结束后，设门。

右击图片，Apply to compensation controls.
调FITC的电压，使得峰值图出现在10^2位置。

调PE的电压，同理。

4，上样，单标FITC，只需load，阳性门移动到阳性峰，不用调节其他。

5，上样，单标FITC，同理。

（上样量如果不够，可以在加样，并record以后，Append继续累积。

）6，计算
文件栏中，Experiment中选中Compensation setup，选中catulate
compensation ,修改需保存的名称，点击link&save。

此后所有实验的Specimen都是和该电压补偿的参数保持一致。

就此补偿结束。

五、检测样本
1，新建Specimen.在Normal Worksheet中点第一个小图标，切换回实验用的Global Worksheet。

2，Browers中，点中生成Tube。

在Acquisition中选next tube,右击rename，在record。

3，上样，双阴性negative，
4，上样，双阳性sample。

六、关机
1，关液流，在Cytometer在选Fluid shutdown，关掉Stream。

2，鞘液桶的气路（透明管）、液路（蓝色管）插到酒精桶的位置。

液路需要从滤器旁边拆开，先插液路，再插气路。

气路足可以放气。

3，取喷嘴，超声2min。

4，放入封闭喷嘴，等待清洗。

5，取出封闭喷嘴
6，Cytometer中standby。

7，关仪器开关，激光开关。

关电脑。

细胞分选
1，鞘液。

1）在70um对话框，点开voltage调加压。

点test sort呈花洒状态，测试分选。

反复点optical filter选择性过滤。

调节下面四个电压，其中一三四为0，反复调整二的值，使得液流在两个空白框内。

2，上accudrop。

1）在文件栏中，选择experiment，选new experiment，出现Experiment Accudrop Delay模式。

逐级点下去，Sepcimen，双击tube，点sort layout，要open sort layout对话框。

调节FSC的电压，使得小于50。

2）点Voltage加电，optical filter中看百分比。

上样速度flow rate 调高使达到2000个/s。

3）点击Sort，在对话框中选择cancel。

4）点击Auto Delay。

Start run。

等待分选左侧框100%数值出现。

退出Exit。

保存数据
3，鞘液。

左右分选位置测试。

1）空白管放入仪器架上，准备对液流位置。

2）70um对话框中，分别点击加压、测试、过滤、去挡板。

3）反复调节两个空白框下的二路和三路电压，时刻查看电压是否能够使仪器上液流打到管子中心，避免到壁上。

4）调节2rd, 3rd,4th数值，先都归零，再依次调。

排除静电干扰，使光束聚焦。

4，样本。

1）更换接受样品管。

2）Sort点OK。

3）打开实验文件夹，呈现书形。

双击experiment，在Global worksheet中画满，P2, P3.
4）上样本管。

Browser中箭头绿色，browser的bar里点create a new sort layout 选择。