白喉疫苗工艺流程菌种

三、百日咳疫苗发展简史
㈠粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其 与 致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活 疫苗，工艺粗造、含量不确定。 ㈡全菌体百日咳疫苗(WPV) 以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝 集原（Agg1、Agg2 、Agg3）。经过50多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题 一直未解决。 ㈢无细胞百日咳疫苗(APV) 20世纪80年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识，产生了APV。 ㈣基因工程疫苗正在研究中。
超滤浓缩
硫酸铵两段盐析
除盐除菌
脱毒 原液 成品
氨离子及无菌检查
甲醛液 37℃ 脱毒试验（家兔） 检定（浓度、纯度、安全等） Al(OH)3吸附 检定（安全、效价等）
七、类毒素的质量检定
1 絮状单位（Lf）
是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量” 而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定 类毒素的絮状单位。
血清学诊断
1.肥达氏试验（widal test） 选择抗原的方法：
ห้องสมุดไป่ตู้
效价测定（脑腔保护力试验）
效价测定方法探讨
•日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定项目进行质量 控制。 •美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同。毒性试验仅要求做HST，效价测定采用EL ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。 •用小鼠脑腔保护力试验（MPT）评价疫苗效果，WPV 的 效价明显高于APV，而且并非所有的APV均可通过MPT试 验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的效价试验方 法。 •免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但 与临床保护之间还缺乏相关性。
表明APV的保护效果是肯定的，能够达到WPA的保护水平。
㈣、接种不良反应
疫苗种类 APV WPV 发热 (%) 0.8-2.8 6.6 持续性喊 (%) 4.5-9.0 20.5 红晕 (%) 1.4-5.5 9.5 肿胀 (%) 1.2-5.5 15.4 疼痛 (%) 1.4-4.8 20.8
表明APV的不良反应明显低于WPV。
类毒素的毒性逆转
温度升高 游离甲醛的浓度低 毒素纯度高
易发生毒 性逆转
防止或减 轻毒性逆 转
提高甲醛浓度、脱毒pH、 脱毒温度和延长脱毒时间； 增加非蛋白氮含量（于精制 毒素中加入赖氨酸、精氨酸 等）
六、白喉疫苗工艺流程
菌种（ PW8株 ） 传代扩增 3～ 4代
发酵罐培养 34～35℃培养对数生长 末期收获，甲苯杀菌。 离心去菌体 收集清液
㈠、生产工艺流程
冻干百日咳菌种（Ⅰ相CS菌株） ↓ 接种血培养基大管培养 ↓36℃ 48-72小时培养 传代 接种发酵罐培养（综合培养基） ↓ 培养≤48小时 收集培养物 ↓ 第一段硫酸铵盐析及浸提 ↓ 第二段硫酸铵盐析及浸提 ↓ 透析 ↓ 密度梯度离心 ↓ 戊二醛脱毒 ↓ 透析 ↓ 超声 ↓ 无细胞百日咳原液
絮状单位测定
毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反 应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼 可见的絮状凝集反应， 根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf ）值。
2 纯度：≥1500Lf/mgPN 3 安全性试验（豚鼠）
七、类毒素的质量检定
4效价测定
类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反应。
四、白喉毒素
1.白喉外毒素为棒状杆菌β-噬菌体tox基因表达 产物,可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋 白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性， 如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。 2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成， 分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55 ℃很快失活。 3.通过物理和化学方法将其纯化。
五、白喉类毒素
毒素经甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性
细 菌 毒 素
甲醛
类毒素
影响脱毒因素
PH
脱毒
甲醛 浓度
温度
温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果
１.温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性， 一般37～38 ℃。 ２.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在 保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱 毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱 毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。 ３.甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。
㈡、主要抗原和生物学活性
1百日咳Ⅰ相菌有两大类抗原 菌体O抗原 表面K抗原（荚膜物质） 2百日咳菌可产生 外毒素(PT) 内毒素 其他生物活性物质，据报道有25种之多。 作用 细胞毒性 免疫原性 PT ＋＋ ＋＋ FHA ＋＋ － ＋＋ Aggs PRN － － ＋ ＋ ＋ ＋ AC － ＋＋ ＋ TCT HLT ＋ ＋ -
细菌性疫苗种类
1 2 3 4 5
霍乱 伤寒
副伤寒 百日咳 疫苗……
卡介苗 鼠疫 布氏杆菌 伤寒 痢疾 霍乱 疫苗……
白喉 破伤风 百日咳 疫苗 ……
脑膜炎 伤寒vi 肺炎 流感嗜 血杆菌 多糖疫 苗……
AC脑膜 炎球菌 多糖结 合疫苗 HIB……
白喉疫苗
百日咳疫苗
伤寒疫苗 结合疫苗
白喉疫苗
一、白喉概述 二、病原学 三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学 四、白喉毒素 五、白喉类毒素 六、生产工艺 七、类毒素的质量检定
㈡、质量检定
检测项目 蛋白含量 抗原纯度测定 热原测定 毒 性 试 验 小鼠体重减轻试验 小鼠白细胞增多试验 小鼠组胺致敏试验 毒性逆转试验 标准 —— PT和FHA不低于总蛋白质 含量的85% 符合规定 不高于10BWDU/ml 不高于0.5PLU/ml 不高于0.8HSU/ml 不高于0.8HSU/ml 不低于4.0IU/剂量
1
2 3
潜伏期为 7～21天 病期为一 个月，恢 复缓慢。
长期发热、 持续高烧 达10～14 天、腹部 不适、头 痛等。
2
表情迟钝 脉搏相对 缓慢，肝 脾肿大和 白细胞减 少。
二、病 原 学
1.细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌， 有鞭毛，能运动。
伤寒沙门氏菌革兰染色
伤寒沙门氏菌电镜形态
2.培养特性
白喉疫苗
白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。 它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病 细菌产生 的外毒素 对心肌损 害
外毒素 对神经 系统损 害
外毒素 对肾脏 损害
主要临床表现为上呼吸道发炎， 常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，
白喉流行特点
1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌 没有中间宿主，病人及带菌者是唯 一的传染原。 2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。 3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时 白喉易感性达高峰。
㈢、APV的效果
接种种类 WPV APV _ APV _ APV _ APV _ 免疫人数 56 36 58 30 42 26 27 62 37 病例数 8 4 48 3 37 1 17 2 30 发病率（%） 14.3 11.3 82.8 10.0 80.0 3.8 62.9 3.2 81.0 1990 1988 1988 报道时间 1983
营养缺 乏症
典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾 声或伴有呕吐，可持续数月。
百日咳流行特点
1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。 2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。 3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1 岁以内婴幼儿发病率50%。
二、病原学
⑴小鼠Vero细胞法
将标准和待检类毒素2倍稀释3～5个稀释度，皮下免疫N IH小鼠8只（0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞 生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进 行结果计算。
⑵豚鼠毒素攻击法
皮下免疫豚鼠10只（1ml/只），免疫4周后用毒素攻击， 观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分 析法进行结果计算。
呼吸道粘附作用 ＋＋
㈢、致病机理
百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 ↑ ↓重患 (FHA PT PRN Agg) 下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 ↓细菌不进入组织和血液循环 ①干扰吞噬细胞功能 ②麻痹上皮细胞功能 ③损伤支气管血管周 围组织 AC TCT HLT 分泌大量PT 细胞代谢发生变化 ①产生血细胞增多 ②组织胺致敏性增强 ③分泌胰岛素增强和 血糖降低.
伤寒疫苗
一、概述 二、病原学 三、伤寒疫发展简史 四、伤寒Vi疫苗
一、 概述
1.伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状 内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病 原是伤寒沙门氏菌。 2.传播途径是食入被污染的食物或水源。 3.学龄儿童发病率最高，两岁以下儿童和 35 岁以上成人发病率低。
典型的临床症状
二、病原学
1.细菌形态
白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰 氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚 膜，不形成芽孢。
白喉棒状杆菌显微镜下形态
白喉棒状杆菌显微镜下形态
二、病原学
2.培养特性 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸 盐，不产生吲哚，不消化蛋白。 3.抵抗力 ⑴.白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和 红霉素极敏感。 ⑵.对消毒剂抵抗力弱，3％苯酚10min可将该菌杀死 ⑶.不耐热，58 ℃10mi或100℃ 1min即可被杀死。
百日咳疫苗
一、百日咳概述 二、病原学 三、百日咳疫苗发展简史 四、无细胞百日咳疫苗 ㈠、生产工艺流程 ㈡、质量检定 ㈢、APV的效果 ㈣、接种不良反应
百日咳概述
百日咳是对儿童威胁非常大的传染病， 它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。 并发症肺炎 形成肺气肿 肺不张，甚 至死亡。
急性脑炎、 呕吐、痉挛 和昏迷，死 亡或脑损伤
四、无细胞百日咳疫苗
•1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的基础 上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。 •1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。 •我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代 中期获得正式生产文号。 •近期的临床试验证明含有5种保护性抗原（PT FHA PRN Agg2 A gg3 ）的APV效果最佳。
㈠细菌形态 百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形
㈡生长特性
1.百日咳菌可分四种相变，Ⅰ相菌毒力最强有免 疫原性；Ⅳ相菌毒力消失，无免疫原性；ⅡⅢ 相菌介于Ⅰ Ⅳ相之间。 2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为35～36℃,最 适pH6.8-7.0。 3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液 化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。
三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学
1. 致病力 自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。 2.毒素产生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。 白喉杆菌的产毒基因是由β嗜菌体携带。 β嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合， 形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前 用于白喉类毒素生产)。
• 在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以 易生长，需氧，适宜温度35-37℃，适宜的pH 为7.0～7.2。 • 发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气； 不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。
抗原结构
1.鞭毛（H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受 （1％）甲醛影响。 2.菌体（O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多 糖（LPS）－由多糖（重复寡 糖和核心寡糖）和类脂A组 成。 3.莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原, Vi抗原与其致病性有关 Vi来源于毒力的缩写。
百日咳疫苗伤寒疫苗结合疫苗白喉疫苗白喉疫苗一白喉概述二病原学三白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四白喉毒素五白喉类毒素六生产工艺七类毒素的质量检定外毒素对神经系统损害害细菌产生的外毒素对心肌损害害外毒素对肾脏损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病
细菌性疫苗
杨丽华
2011年3月
细菌性疫苗 1. 死疫苗 2. 活疫苗 3. 蛋白类疫苗 4. 多糖类疫苗 5. 多糖蛋白结合疫苗