基于荧光PCR检验方法对食品中沙门氏菌检验的分析研究
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（1）添加模板。剪下所需测试数的已含有反应液的 PCR 管，放置在室温待解冻后，离心 30 s 后揭开封口膜，向每 管反应液中分别加入 5 μL 模板，顺序为空白、阴性对照、 待测样品模板、阳性对照。盖好配套的 PCR 管盖后，涡旋 混匀 30 s，离心 1 min，立即进行 PCR 扩增反应。
（2）扩增反应。使用荧光定量 PCR 仪，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 TAMRA。
100 ℃水浴 15 min。③ -20 ℃放置 30 min。④ 37 ℃解冻后， 用离心机 12 000 r/min 离心 5 min，取得的上清液为沙门氏 菌的 DNA。
（2）TIANGEN 细菌基因组使用 DNA 提取试剂盒提取。 具体操作步骤参照试剂盒说明书。
1.3.2 食品样品 DNA 提取 致病菌是活的生物物质，为了得到大量的可检测致病
实 时 荧 光 定 量 PCR 仪（CFX96TMOptics Moduie，BIORAD）；高速离心机（HC-1016，安徽中科中佳科学仪器有 限公司）；生物安全柜（SC1100 Ⅱ B2-X，生济南鑫贝西生 物技术有限公司） 1.3 实验方法 1.3.1 DNA 制备
（1）标准菌株。①取沙门氏菌复壮菌液 1 mL 于 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液。②用 PBS 将沉淀的菌体洗涤 2 次，加入 100 µL 已灭菌超纯水中，于
对一株沙门氏菌和 3 株非沙门氏菌及 30 个食品样品， 用建立的 PCR 反应体系和反应条件进行实时荧光定量 PCR 反应。由图 1 知，沙门氏菌的检测结果为阳性，而非沙门氏 菌检测可知，结果为阴性，食品样本为阴性，PCR 方法比 较传统增菌培养方法更具时效性的优势，通过此次检验数据 结果的比较，表明建立的实时荧光定量 PCR 检测技术具有 良好的的灵敏性、时效性和特异性，PCR 方法和传统方法 对比检测结果见表 1。
Amplification
1500
检验食品：熟肉制品、糕点和餐饮常见食品等。沙门 氏阳性菌标准菌株：乙型副伤寒沙门氏菌；非沙门菌阳性标 准菌株：金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌 O157:H7；细菌基因组 DNA 提取试剂盒（TIANGEN）；旋 达 R1 致病菌生物检测系列“沙门氏菌核酸检验试剂盒”（双 螺旋基因公司）。 1.2 仪器与设备
关键词：食品安全；沙门氏菌；PCR
食品安全是当今社会非常关注的话题，而食品安全多 是由于食源性致病菌所致，沙门氏菌是近年来食源性致病菌 最主要原因之一，所以快速有效的检测方法有利于减少食品 安全的事件的发生。荧光 PCR 法检测致病菌病源，以其特 异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭 反应等优点而成为分子生物学研究中的重要工具 [1-2]。传统 的食品安全国家标准规定沙门氏菌的检验需要前增菌、二次 增菌、平板分离、生化鉴定及血清学分析等步骤，培养时间 长，出具实验结果需要至少 5 d 时间。其他如以抗原 - 抗体 反应为基础的检测方法，如免疫酶实验、免疫扩散法、乳胶 凝集实验、免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等，使得沙门菌 的检测受到一些限制 [3]。因此，快速、准确、高效的检测方 法是大势所趋，对快速及时发现致病菌，控制污染起到积 极作用。目前最成熟的技术就是实时定量 PCR 检测致病菌 病源。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂
菌，可以取一定量食品在培养基中进行培养增菌。培养增菌
还可以简化介质，减少复杂食品介质对 PCR 的抑制影响。 ①称取 25 （g mL）样品加入到 225 mL 缓冲蛋白胨水 BPW 增 菌液培养基中，36 ℃增菌培养 18 h。②取出 1 mL 增菌培养 后的样品于 1.5 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 10 min。③将 上清液用移液枪转移至新的 1.5 mL 离心管中，用离心机 12 000 r/min 离心 5 min。④弃去上清液，用 PBS 悬浮菌体， 离心洗涤 2 次。⑤提取细菌基因组 DNA。 1.3.3 实时荧光定量 PCR 扩增
（3）PCR 反应条件。①预变性：95 ℃，10 min，1 个循环。 ②扩增：95 ℃，15 s；60 ℃，45 s。40 个循环。在 60 ℃时 收集荧光。荧光通道选择 FAM。 1.3.4 结果判断
①检测样品 Ct ≥ 40.0，曲线为直线或轻微斜线，无 “S”型 扩 增 曲 线， 样 品 阴 性， 不 含 沙 门 氏 菌。 ② 检 测 样 品 Ct ≤ 35.0，曲线为“S”型扩增曲线，样品阳性，含有沙门氏菌。 ③检测样品 35.0 ＜ Ct ＜ 40.0，需进行一次重复实验。
分析检测
基于荧光 PCR 检验方法对食品中 沙门氏菌检验的分析研究
பைடு நூலகம்
孔庆岩，胥小荣，庞 婕，王艳英，苗育可
（承德市食品药品检验检测中心，河北承德 067000）
摘 要：目的：针对国家标准中沙门氏菌检验周期比较长的问题，探究利用 PCR 检测致病菌病源的方法。方法：利用 沙门氏菌特异性片段作为 PCR 扩增的靶序列，制作相应模板，进行实时荧光 PCR 扩增，找到最佳方案，选择 30 份食品采取 实时荧光定量 PCR 检测方式进行检测，同时对同等份数食品运用传统方法的进行检测，随机分为研究组和参照组，对两组 食品的食源性致病菌总检出率进行对比。结果：利用 PCR 检测沙门氏菌正确率和国家标准相似，检验时效大幅缩短。结论： 利用实时荧光定量 PCR 技术检测食品中沙门菌，为食源性沙门菌污染的快速检验提供方法学支持。
为确保检验结果的准确性，在进行实际样品检测时，
设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光 PCR
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分析检测
反应体系，在检验区进行检测，检测结束后，根据扩增曲线 盒 Ct 值判定结果。 2 结果与分析
（2）扩增反应。使用荧光定量 PCR 仪，荧光基团选择 FAM，淬灭基团选择 TAMRA。
100 ℃水浴 15 min。③ -20 ℃放置 30 min。④ 37 ℃解冻后， 用离心机 12 000 r/min 离心 5 min，取得的上清液为沙门氏 菌的 DNA。
（2）TIANGEN 细菌基因组使用 DNA 提取试剂盒提取。 具体操作步骤参照试剂盒说明书。
1.3.2 食品样品 DNA 提取 致病菌是活的生物物质，为了得到大量的可检测致病
实 时 荧 光 定 量 PCR 仪（CFX96TMOptics Moduie，BIORAD）；高速离心机（HC-1016，安徽中科中佳科学仪器有 限公司）；生物安全柜（SC1100 Ⅱ B2-X，生济南鑫贝西生 物技术有限公司） 1.3 实验方法 1.3.1 DNA 制备
（1）标准菌株。①取沙门氏菌复壮菌液 1 mL 于 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液。②用 PBS 将沉淀的菌体洗涤 2 次，加入 100 µL 已灭菌超纯水中，于
对一株沙门氏菌和 3 株非沙门氏菌及 30 个食品样品， 用建立的 PCR 反应体系和反应条件进行实时荧光定量 PCR 反应。由图 1 知，沙门氏菌的检测结果为阳性，而非沙门氏 菌检测可知，结果为阴性，食品样本为阴性，PCR 方法比 较传统增菌培养方法更具时效性的优势，通过此次检验数据 结果的比较，表明建立的实时荧光定量 PCR 检测技术具有 良好的的灵敏性、时效性和特异性，PCR 方法和传统方法 对比检测结果见表 1。
Amplification
1500
检验食品：熟肉制品、糕点和餐饮常见食品等。沙门 氏阳性菌标准菌株：乙型副伤寒沙门氏菌；非沙门菌阳性标 准菌株：金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌 O157:H7；细菌基因组 DNA 提取试剂盒（TIANGEN）；旋 达 R1 致病菌生物检测系列“沙门氏菌核酸检验试剂盒”（双 螺旋基因公司）。 1.2 仪器与设备
关键词：食品安全；沙门氏菌；PCR
食品安全是当今社会非常关注的话题，而食品安全多 是由于食源性致病菌所致，沙门氏菌是近年来食源性致病菌 最主要原因之一，所以快速有效的检测方法有利于减少食品 安全的事件的发生。荧光 PCR 法检测致病菌病源，以其特 异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭 反应等优点而成为分子生物学研究中的重要工具 [1-2]。传统 的食品安全国家标准规定沙门氏菌的检验需要前增菌、二次 增菌、平板分离、生化鉴定及血清学分析等步骤，培养时间 长，出具实验结果需要至少 5 d 时间。其他如以抗原 - 抗体 反应为基础的检测方法，如免疫酶实验、免疫扩散法、乳胶 凝集实验、免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等，使得沙门菌 的检测受到一些限制 [3]。因此，快速、准确、高效的检测方 法是大势所趋，对快速及时发现致病菌，控制污染起到积 极作用。目前最成熟的技术就是实时定量 PCR 检测致病菌 病源。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂
菌，可以取一定量食品在培养基中进行培养增菌。培养增菌
还可以简化介质，减少复杂食品介质对 PCR 的抑制影响。 ①称取 25 （g mL）样品加入到 225 mL 缓冲蛋白胨水 BPW 增 菌液培养基中，36 ℃增菌培养 18 h。②取出 1 mL 增菌培养 后的样品于 1.5 mL 离心管中，4 000 r/min 离心 10 min。③将 上清液用移液枪转移至新的 1.5 mL 离心管中，用离心机 12 000 r/min 离心 5 min。④弃去上清液，用 PBS 悬浮菌体， 离心洗涤 2 次。⑤提取细菌基因组 DNA。 1.3.3 实时荧光定量 PCR 扩增
（3）PCR 反应条件。①预变性：95 ℃，10 min，1 个循环。 ②扩增：95 ℃，15 s；60 ℃，45 s。40 个循环。在 60 ℃时 收集荧光。荧光通道选择 FAM。 1.3.4 结果判断
①检测样品 Ct ≥ 40.0，曲线为直线或轻微斜线，无 “S”型 扩 增 曲 线， 样 品 阴 性， 不 含 沙 门 氏 菌。 ② 检 测 样 品 Ct ≤ 35.0，曲线为“S”型扩增曲线，样品阳性，含有沙门氏菌。 ③检测样品 35.0 ＜ Ct ＜ 40.0，需进行一次重复实验。
分析检测
基于荧光 PCR 检验方法对食品中 沙门氏菌检验的分析研究
பைடு நூலகம்
孔庆岩，胥小荣，庞 婕，王艳英，苗育可
（承德市食品药品检验检测中心，河北承德 067000）
摘 要：目的：针对国家标准中沙门氏菌检验周期比较长的问题，探究利用 PCR 检测致病菌病源的方法。方法：利用 沙门氏菌特异性片段作为 PCR 扩增的靶序列，制作相应模板，进行实时荧光 PCR 扩增，找到最佳方案，选择 30 份食品采取 实时荧光定量 PCR 检测方式进行检测，同时对同等份数食品运用传统方法的进行检测，随机分为研究组和参照组，对两组 食品的食源性致病菌总检出率进行对比。结果：利用 PCR 检测沙门氏菌正确率和国家标准相似，检验时效大幅缩短。结论： 利用实时荧光定量 PCR 技术检测食品中沙门菌，为食源性沙门菌污染的快速检验提供方法学支持。
为确保检验结果的准确性，在进行实际样品检测时，
设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光 PCR
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分析检测
反应体系，在检验区进行检测，检测结束后，根据扩增曲线 盒 Ct 值判定结果。 2 结果与分析