宁波口岸首次截获十二齿小蠹伞滑刃线虫

宁波口岸首次截获十二齿小蠹伞滑刃线虫
郑炜;顾建锋
【摘要】宁波出入境检验检疫局植检实验室于2007年12月从来自德国的木质包装中截获一种伞滑刃属线虫.经形态学比较、测量以及ITS-RFLP图谱比对,鉴定为十二齿小蠹伞滑刃线虫(Bursaphelenchus sexdentati).目前国内尚无该线虫的报道.
【期刊名称】《浙江林业科技》
【年(卷),期】2008(028)006
【总页数】4页(P43-46)
【关键词】木质包装;十二齿小蠹伞滑刃线虫;鉴定;ITS-RFLP
【作者】郑炜;顾建锋
【作者单位】宁波出入境检验检疫局,浙江宁波,315012;宁波出入境检验检疫局,浙江宁波,315012
【正文语种】中文
【中图分类】S432.2
2007年12月，宁波出入境检验检疫局植检实验室从一批来自德国的木质包装中截获十二齿小蠹伞滑刃线虫（Bursaphelenchus sexdentati），这是我国口岸首次截获该线虫，国内目前尚未见有关该线虫的报道。

现将结果报道如下。

1.1 样本采集
该批货物来自德国，松木包装上有溴甲烷熏蒸处理标记，蓝变症状不明显，未发现
昆虫为害状。

采集数块木段送实验室检测。

1.2 线虫分离、培养、形态鉴定
1.2.1 线虫分离采用改良漏斗法进行线虫分离。

将木样劈成长100 mm、宽10 mm左右的薄片，置于漏斗中，加入适量水（以盖没薄片为宜），25℃恒温培养24 h后，用表面皿接取5～10 mL线虫分离液，镜检。

1.2.2 线虫纯培养将30余条线虫挑入无菌蒸馏水中漂洗3次，移入长满灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的PDA培养基中，大约10 d后，即可获得大量的线虫。

1.2.3 形态鉴定与测量用Zeiss Axioskop 40显微镜和Leica DFC 320数码相机对线虫的整体形态和内部特征进行观察、摄影，并用De Man公式法进行形态特征测计。

根据形态特征和测计结果，结合相关文献，对该线虫种类进行鉴定。

1.3 ITS-RFLP鉴定
1.3.1 线虫DNA提取挑取1～5条线虫放入预先加有8 μL ddH2O的离心管中，后加入1μL 10×PCR缓冲液和1μL蛋白酶K（1 mg/mL），混合并简单离心，放入-70 ℃冰箱冷冻数小时或过夜。

取出后放入PCR仪（或水浴锅），65 ℃保温1 h，95℃ 10 min。

制备的DNA模板直接用于PCR扩增反应。

1.3.2 PCR扩增加入相关试剂建立25μL的反应体系：
2.5 μL 10×PCR Buffer （含Mg2＋），2μL 0.1 mM dNTP，1.5μL 10μM上游引物（5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’），1.5μL 10 μM下游引物（5’-TTTCA CTCGCCGTTACTAAGG-3’），0.3μL 2U Taq酶，5μL DNA模板，加水补足到25μL。

然后放入PCR仪中，扩增反应程序为：94℃ 4 min，94℃ 40 s，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，36个循环，72℃ 8 min。

1.3.3 电泳检测使用1％的琼脂糖凝胶电泳，上样量5μL，Marker为DL2000
5μL。

稳定电压100 V/cm，电泳40 min，在紫外灯下观察凝胶，以电泳条带的亮度确定PCR产物的浓度和纯度，目的片断大小应该为1 kb左右。

1.3.4 PCR产物酶切分别用RsaⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和AluⅠ五种限制性内切酶对PCR产物进行了酶切。

向200μL的PCR管中加入1μL限制性内切酶、
1μLBuffer、2μL去离子水、6μL PCR产物，放入水浴锅中，37℃条件下保温3 h。

然后电泳，Marker为100 bp DNA ladder，凝胶浓度为2％，其他同上。

凝胶成像，获得线虫的ITS-RFLP指纹图谱。

2.1 分类地位
十二齿小蠹伞滑刃线虫（Bursaphelenchus sexdentati），隶属于滑刃目（Aphelenchida），滑刃总科（Aphelenchoidoidea），寄生滑刃科（Parasitaphelenchida），伞滑刃属（Bursaphelenchus）。

2.2 测量值
具体测量值如表1所示。

2.3 形态描述
雌虫：虫体细长，热杀死后，虫体明显向腹面弯曲，表皮有明显的环纹。

侧区宽3～4μm，侧线4条。

唇区高，明显缢缩，高约3.5μm，宽约7.5μm；口针长约15μ m，无口针基球，基部轻微膨大，针锥部大约占口针长度的40％。

中食道球
卵圆形，长大于宽；排泄孔位于中食道球基部对应处或略靠后；食道腺从背面覆盖肠，约2.5～3.0倍体宽。

单生殖腺前伸，约占体长的1/3～1/2；卵母细胞单行排列，后阴子宫囊约占肛阴距的1/2；阴门前唇略向后延伸形成小阴门盖，后唇略膨大，随后形成明显的缢缩，偶见后唇膨大非常显著。

尾圆锥形，渐变细，末端多变，多数钝圆，有时呈方圆形，有时略尖，偶尔有尾尖突；尾长约为2.8倍肛门体宽。

雄虫：热杀死后，虫体向腹面弯曲，呈“C”形，前部似雌虫。

单精巢前伸，占体长的1/4～1/2，精母细胞多行排列；交合刺成对，不愈合，显著向腹面弯曲；喙
突长2.0～2.5μm，末端锐尖，着生于交合刺基部；基顶略向腹面弯曲，高2.2～2.5μm，基部近方形，冠状体无小凸起，基顶至喙突的距离为7～8μm；交合刺远
端有小的盘状突（通常不明显）。

尾尖，强烈弯曲成爪状，末端具铲形的交合伞；具尾乳突7个，肛前1个并紧邻着1对，1对位于尾中后部，最后1对位于交合
伞起始处。

2.4 与近似种区别
根据具4条侧线、交合刺形状、具有小阴门盖、尾乳突的位置等特征，将
B.sexdentati、B.vallesianus、B.pinophilus、B.poligraphi、B.borealis、
B.incurvus、B.piniperdae等归属于B.sexdentati组［1］。

该组线虫形态特殊，很容易与其他线虫区别，但sexdentati组内种类通过形态很难区分。

B.sexdentati与B.vallesianus十分相似，区别在于雌虫尾部形状，前者尾更钝圆，后者尾呈锥形；且B.sexdentati口针略长（15μm对比13μm）。

另外，
B.sexdentati交合刺喙突末端较B.vallesianus更尖锐，冠状体上没有小凸起，基顶至喙突尖距离较大（7～8μm对比5～6μm）［2］。

与B.borealis比较，后者虫体更粗短（c = 22～25对比c = 21～24），交合刺
基顶明显向背面弯曲。

与B.poligraphi比较，后者雌虫尾呈楔形，末端尖；交合刺更粗壮，基顶更高。

与B.incurvus比较，后者喙突着生于交合刺中部，交合伞呈方形。

与B.piniperdae比较，后者雌虫尾圆柱形，末端钝圆，阴门后没有缢缩；口针略
长（14～15μm对比18～19μm），交合刺稍长（16～18μm对比17～19μm）。

与B.pinophilus比较，后者交合刺基顶多变，基顶至喙突的距离更长（5～6μm
对比7～8μm）。

另外，后者雌虫尾末端锐尖，有时有尾尖突。

2.5 PCR-RFLP图谱
将获得的 ITS-RFLP 图谱与十二齿小蠹伞滑刃线虫的比较，片段大小一致，鉴定为十二齿小蠹伞滑刃线虫（图2）。

其具体酶切片段大小见表2。

十二齿小蠹伞滑刃线虫最早于1958年在德国发现并报道，目前主要分布于俄罗斯、
瑞士、希腊、意大利、葡萄牙等欧洲国家。

该线虫一般由十二齿小蠹（Ips sexdentatus）携带并传播，生活于木材或小蠹虫的蛀孔中。

有关寄主树种主要是松树（Pinus sp.）和云杉（Picea sp.）。

目前对B.sexdentati组线虫中的B.sexdentati、B.vallesianus、B.pinophilus、B.poligraphi、B.borealis 5种已进行了分子生物学研究，确定为有效种。

对于组内的其它种是否有效，还有待进一步考证。

1980年，Baujard等从法国海岸松（Pinus pinaster）中发现的B.naujaci，与B.sexdentati十分接近，可能是异名。

该线虫在我国目前还没有发生的报道。

因此，要加强对进境木质包装的检疫，防止其传入我国。

【相关文献】
［1］ Braasch H.Bursaphelenchus species in conifers in Europe： distribution and morphological relationships［J］.EPPO Bulletin，2001，31（3）：127－142.
［2］BraaschH， Schonfeld U， Polomski J， et al.Bursaphelenchus vallesianus sp.n.-a
new species of the Bursaphelenchus sexdentati group （Nematoda：Parasitaphelenchidae）［J］.Nematology.Medit，2004（32）：71－79.
［3］W.Michal， Baujard P.Morphology and morphometrics of Bursaphelenchus (Nematoda： Aphelenchoididae) species from pine wood of Poland［J］.Annales Zoologici (warszawa)， 1997，47（3/4）：305－319.
［4］Akbulut S.First record of Bursaphelenchus vallesianus Braasch， Schonfeld，Polomski， and Burgermeister in Turkey［J］.Turkey Journal of Agriculture Forest，2008（32）：1－7.。