FL09 08色谱分离
常见色谱仪的色谱分离原理
常见色谱仪的色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1.液固色谱法：使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。
分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。
适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分离同分异构体。
2.液液色谱法：使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。
分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。
由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。
现在多采用的是化学键合固定相，如C18、 C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法：采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。
反相色谱法：一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。
色谱分离法
d. Sketch the elution profile of these proteins from a carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography column, run at pH 6.25 (with a salt gradient, if necessary). Label the peaks.
20
8
Sephacryl 烯丙烯基葡聚糖与N、N’-亚甲基 双丙烯酰胺经共聚而制备的一种共价交联 的刚性珠体。 S-200 5000~250,000 S300/400/500/1000
Sepharose琼脂糖凝胶2B/4B/6B
Sepharose CL交联琼脂糖 琼脂糖与2，3-二 溴丙醇在强碱性条件下反应而得。
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■ 胶体过滤法的胶粒：
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■ 胶柱的装填方法：
清预
加上 reservoir
洗估
胶体
体积
检
装
查
填
Gel
好
胶
管
体
柱
是
否
静温 缓 置度 冲 胶平
畅 通
液 体衡
平
暂
继
衡
停
续
1
流
流
2 Gel
洗X
洗
加上 adaptor
上 清
沉
积
中
紧
已
密
堆
堆
积
积
加 压 流 洗
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装置示意图
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凝胶过滤色谱图
各类色谱中溶质与固定相间的相互作用力
色谱种类 体积排阻色谱（size exclusion chromatography）SEC 凝 胶 过 滤 色 谱 (gel filtration chromatography)GFC 离 子 交 换 色 谱 (Ion exchange chromatography)IEC 聚焦色谱 正相色谱
厦门大学有机化学实验 实验十一 亚甲基蓝与荧光黄的分离
化学实验教学示范中心
三、实验步骤及注意事项
4、加完吸附剂后，在吸附剂上再盖一张直径大小合适的小滤 纸。 5、当溶剂的液面刚好流至滤纸面时关闭二通活塞，立即用移 液管加入1mL亚甲基蓝和荧光黄的乙醇混合液，尽量避免待分 离混合液粘附在柱的内壁上。 6、打开二通活塞，等柱内的溶剂恰好流到滤纸面时，关闭二 通活塞，向柱内加入70%乙醇，打开二通活塞进行洗脱。
1、分离混合物
2、精致提纯化合物 3、利用比移值（Rf）鉴定化合物
4、跟踪反应进程
化学实验教学示范中心
柱色谱
由于不同化合物吸附能 力不同，因而在洗脱时以不 同的速度沿柱向下流动，吸
附能力弱的组分随溶剂首先
流出。在连续洗脱过程中， 不同组分或不同色带就能分 别收集，从而达到分离纯化 的目的。
化学实验教学示范中心
柱色谱
1 吸附剂
常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭 或纤维素粉。 选择吸附剂的首要条件：不与被分离物或展开剂发生化学 反应。
吸附能力与以下几点有关：
（1）吸附剂颗粒大小（100～150目）
（2）吸附剂含水量（6％～10％，II～III级）
化学实验教学示范中心
柱色谱
2 溶剂
通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附 活性等来考虑。先将带分离的样品溶于尽量少的非极性 溶剂中，从柱顶流入柱中，依次增大溶剂的极性，将不 同化合物依次洗脱（梯度洗脱）。 常用洗脱剂的极性：
化学实验教学示范中心
三、实验步骤及注意事项
7、用锥形瓶收集蓝色的亚甲基蓝溶液。【洗脱时切勿使溶剂 流干】 8、当蓝色溶液收集完后，等柱内的70%乙醇溶液恰好流到滤纸 面时，关闭二通活塞，加入适量2%氨水作为洗脱剂。打开二通 活塞收集黄绿色的荧光黄溶液，直到其完全被洗出。
氟硅唑20%水分散粒剂的气相色谱分析
ｓａ ｄ ｒ ｄ ｓｏｖ ｄｗｉ ｃ ｔｎ ， ａ ｄ ｕ ｉｇＨＰ ， ３ ｍｘ ．３ ｔｎ ａｄ， ｉｓｌｅ ｔ ａ ｅｏ ｅ ｈ ｎ ｓｎ 一１ ０ Ｏ５ ｍｍｘ ．５ ｒ ， ｆ ｓｄ ｓｌ ａｃ ｐｌ Ｏ２ ｕ ｎ ｕ ｅ ｉ ｃ ａ ｉ ｉ —
ｌｒ ｏ ｕ ｎ ｙ ｒ ｇ ｎ ｆ ｍｅ ｄ ｔｃ ｏ ｏ ｓ ｐ ｒ ｔ ｎ ｅ ｅ ｍｉ ａ ｅ ｔ ｅ ｓ ｅ ｉ ｎ Ｔ ｅ ｅ ｐ ｒ— ａ ｙ ｃ ｌ ｍｎ ａ ｄ ｈ ｄ ｏ ｅ ａ ｅｅ ｔ ｒｔ ｅ ａ ａｅ ａ ｄ ｄ ｔ ｒ ｎ ｔ ｈ ｐ ｃｍｅ ． ｈ ｘ ｅ ｉ ｌ
及 试 样 前 后 两 针 标 样 溶 液 中氟 硅 唑 与 内 标 物 峰
面积 之 比分 别 进 行 平 均 ．氟硅 唑 质 量 百分 含量 Ｘ ，按 下式 计算 ：
＝
上 述 气相 色 谱操 作 条件 ，系 典 型操 作 参数 ，
可 根 据 不 同仪 器 特 点 ，对 给 定 的 操 作 参 数 作 适 当调 整 ， 以期 获 得 最 佳 效 果 。氟 硅 唑 标 样 和 试 样 的气 相色谱 图 （ 、２ 。 图１ ）
枷
０
０
啪
Ｏ
２ ４ ３ 测定 ．．
在 上 述操 作 条件 下 ，待 仪器 基线
稳定 后 ，连续 注入数 针标样 溶 液 。计 算各 针相对 响应 值 ．待 相 邻 两 针 的相 对 响应 值 变 化 ＜ ． ， １％ ０
按 照 标 样 溶 液 、试 样溶 液 、试 样 溶 液 、标 样 溶
法对 氟 硅 唑试 样 的 同一样 品平 行测 定５ ，所得 次 结 果 （ １ ：标 准 偏 差 为 ０１ 表 ） ． ０，变 异 系 数 为
FL09 05萃取3
(1)静电作用力
• 因此，如果静电作用是蛋白质增溶过程的主要推动 力 • 对于阳离子表面活性剂形成的反胶团体系，萃取只 发生在水溶液的pH＞pI时，此时蛋白质与表面活性 剂极性头间相互吸引，而pH＜pI时，静电排斥将抑 制蛋白质的萃取； • 对于阴离子表面活性剂形成的反胶团体系，情况正 好相反。
（2）位阻效应
离子强度对萃取率的影响
• 离子强度对萃取 率的影响主要是 由离子对表面电 荷的屏蔽作用所 决定的。盐的浓 度越高，其影响 就越大。 • 不同蛋白质开 始下降时的KCl 浓度也是不同的。
表面活性剂类型的影响
• 前面已经提到阴离子表面活性剂、阳离子表面活 性剂和非离子表面活性剂都可用于形成反胶团， 关键是应从反胶团萃取蛋白质的机理出发，选用 有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷 间的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂， 除此以外，还应考虑形成反胶团及使反胶团变大 (由于蛋白质的进入)所需的能量的大小、反胶团 内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生 影响。
一、什么是反胶团
• 是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发 地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅 为纳米级的集合体。是一种自我组织和排列而成的， 并具有热力学稳定的有序构造。 • 所以表面活性剂是反胶团溶液形成的关键
构成反胶团的表面活性剂种类
• （1）阴离子表面活性剂 • AOT（2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠 ） • （2）阳离子表面活性剂 • 季铵盐
优点
• 从所得结果来看，反胶团萃取具有成本低、溶剂可 反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。 此外，反胶团萃取还有可能解决外源蛋白的降解， 即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题， 而且由于构成反胶团的表面活性剂往往具有溶解细 胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质 和酶。可见，反胶团萃取技术为蛋白质的分离提取 开辟了一条具有工业开发前景的新途径。
色谱分离技术凝胶筛分课件
在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向
前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移
动速度(u b )总是小于流动相的移动速度(u m )，而等于流
动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时
间分数之积：
ub um(11k')
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工 成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型 号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺 凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美 国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共 10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的 排阻限度。
无机填料：
表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶 颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以 外的其他效应。
优点：
可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具 有较高的柱效率和分离度。
缺点：
pH的适用范围窄。以硅胶为基质的填料，pH范围在 2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速 率加快，减少柱子寿命。
层析分离操作过程
液相色谱的基本原理和参数
保留时间(tR)和保留体积(VR)
从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所
需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间
内冲洗剂（流动相）
VR tR•F
流过的体积为保留体积，用VR 表示。
理论塔板数的计算公式为：
N (tR )2
色谱流出曲线及参数
容量因子k 和平衡常数K 某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两
色谱分离过程详解演示文稿
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固定相 固定相是表面具有许多吸附中心的吸附剂，常用吸 附剂硅胶表面的硅醇基为吸附中心。经典液相柱色 谱和薄层色谱使用一般硅胶，高效液相色谱常用球 型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。 （1）对吸附剂的要求 ①有大的表面积和足够的吸附能力； ②对不同的化学成分有不同的吸附力，能较好地把 混合物分开； ③与流动相、溶剂及样品中各成分不起化学反应； ④在所用的溶剂及流动相中不溶解； ⑤颗粒均匀，操作过程中不会碎裂。
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B.纸色谱法（paper chromatography） 纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在 滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位 置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进 行定性和定量分析。
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C.薄层色谱法 (thin-layer chromatography, TLC) 薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布 在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法 操作以达到分离目的。
量(KP=0)。 ➢ 分子量范围：排斥极限(KP=0)与全渗透点(KP=1)之
间的分子量范围。 选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。
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（2）吸附剂的类别 ①有机类 淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纤维素等 ②无机类 氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、 硅藻土
等
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流动相 （1）要求 ①应使用较纯试剂，含杂质会影响洗脱能力 ②与样品或吸附剂不发生化学反应 ③能溶解样品中各成分，且各被分离组分有不同的K值 ④粘度小，易流动
色谱分离方法(DOC)
色谱分离方法[1]根据分离原理还可将色谱法分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳色谱、气相色谱等。
利用物质吸附能力不同进行分离的称为吸附色谱，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树脂等。
利用物质在两相不互溶的溶剂中的分配比不同进行分离的称为分配色谱，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维粉等，液滴逆流色谱（DCCC, droplet counter current chromatography）和高速逆流色谱(HSCCC , high speed counter current chromatography)则是在分配色谱与逆流分溶相结合的基础上发展而成的一种新技术。
利用物质解离程度不同进行分离的称为离子交换色谱，常用的离子交换树脂有强酸型（磺酸型）、强碱型（季胺型）、弱酸型（羧酸型）、弱碱型（三级胺型）等。
利用物质分子大小不同进行分离的称为凝胶色谱（亦称分子筛或排阻色谱），常用的支持剂有葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。
利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离的称为电泳色谱，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳等。
本书将根据其在天然药物分离工作中的重要性择要介绍。
色谱法的特点是分离效果好，对于经典方法难以得到分离的化合物采用色谱法往往可以得到满意的分离，但对于所用的吸附剂或支持剂、试剂、仪器设备等要求较高，技术操作较细致，操作周期也较长，故在工业生产中用得较少，目前主要是作为一种实验室常规分离方法用于天然药物中生物活性成分及化学成分的研究。
由于天然药物中有效成分的结构类型不同，理化性质也不同，所以选择的色谱方法也是不同的，要根据具体情况选定。
通常生物碱的分离可选用硅胶或氧化铝色谱，对于极性较强的生物碱可选用分配色谱或反相色谱，对于碱性较强的生物碱可选用离子交换色谱，对于水溶性生物碱如季胺型生物碱、氮氧化物生物碱等也可选用分配色谱或离子交换色谱。
苷类化合物的色谱分离与苷元的性质有关，对于水溶性较大的苷如皂苷、强心苷等通常采用分配色谱或反相色谱分离，对于水溶性较小的苷则可采用吸附色谱分离。
凝胶渗透色谱的分离原理
凝胶渗透色谱的分离原理凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC），又称为分子排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC），是一种基于分子大小分离的色谱技术。
它应用于高分子聚合物及其他大分子化合物的分子量分析，以及分子构象的研究。
GPC的分离原理可以总结为三个关键步骤：样品溶液在凝胶填料中的渗透，排除与凝胶交互的大分子，保留与凝胶交互的小分子。
以下将详细介绍这三个步骤。
首先，样品溶液在凝胶填料中的渗透。
凝胶填料通常是由高分子材料制成的，孔隙大小是一个连续分布的范围。
当样品分子进入填料孔隙中时，分子要么与填料相互作用，要么通过填料的孔隙空间渗透。
较大的分子普遍难以渗透凝胶填料，而较小的分子则更容易渗透。
这导致了样品分子的渗透行为呈现出分子大小的依赖性。
其次，排除与凝胶交互的大分子。
由于大分子的体积较大，因此它们在填料孔隙中遇到更多的障碍，渗透速率较慢。
大分子更多地在填料的外部进行排除，凝胶填料的流速较快，较大的分子会稍微快一些，较小的分子则相对较慢。
通过这种方式，较大的分子会被迅速排除，而较小的分子则进一步渗透进入填料孔隙。
最后，保留与凝胶交互的小分子。
较小的分子可以比较容易地渗透凝胶填料，它们能够进一步进入填料孔隙，尺寸不受孔隙限制。
当这些分子进入孔隙后，由于它们与填料相互作用，导致它们的停留时间延长。
因此，较小的分子需要更长的时间才能通过整个填料层。
通过这种方式，较小的分子会保留在填料层的内部，从而实现对分子大小的分离。
在GPC中，使用一系列标准物质的分离曲线来校正样品的保留时间。
通过比较标准物质的保留时间以及它们的分子量，可以获得样品分子量的估计。
此外，对填料孔隙大小的了解也非常重要，因为填料的孔隙大小分布会影响渗透分子的分离效果。
通常情况下，会选择与待测样品分子大小范围相匹配的填料。
总结起来，凝胶渗透色谱(GPC)利用填料的孔隙结构以及样品分子的渗透性对样品中的大分子和小分子进行分离。
FLASH快速制备色谱分离提纯的方法学习课程
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第七页，编辑于星期五：十九点 三十分。
flash正相应用
四 上样方法的选择 湿法和干法
： 湿法上样 一般样品的溶解性较好时可以采用湿法上样，湿法上样具有方 便损失少的特点。但必须注意湿法上样的溶剂必须是淋洗剂中极性较小的溶 剂或掺入百分比较少的极性溶剂，否则组份将很容易被洗脱下来。且溶剂量 不宜超过柱体积的10%
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第二十一页，编辑于星期五：十九点 三十分。
ISCO COMPANION的操作
点击tools主要用于冲洗柱子和系统，点击manual control 进入 以下界面
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第二十二页，编辑于星期五：十九点 三十分。
ISCO COMPANION的操作
这里有冲洗流动相和空气，前者是用于冲洗系统和柱子，后者是用于压 干体系和柱子
此图为flash仪器的一个简单构造图
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第二页，编辑于星期五：十九点 三十分。
flash与传统柱层析的比较
• 省时 • 省力 • 省溶剂 • 紫外检测易判断目标产物 减少点板次数
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第三页，编辑于星期五：十九点 三十分。
flash的应用与操作
• flash正相应用 • flash反相应用 • flash仪器操作
flash反相应用
四 反相样品的上样
反相上样我们一般都采用液体上样，一般用水，甲醇，四氢呋喃，乙腈，
D M F, D M S O 等 溶 剂 来 溶 解 样 品 。 选 取 能 使 样 品 溶 解 状 态 最 好 的 溶 剂 溶 解 ！ 最 好 是
100mg样品能溶解在1ml溶剂中为佳！
样品中的重金属和催化剂以及一些与水不互溶的正相溶剂都要处理掉，才能 上反相柱子。
分离科学与技术ppt课件
tR2
16R2 ( )2 1
(k2 1)3 k2
2
H u
影响分离时间的因素
• 分离度增加，分离时间增加；
• 流动相速度加快，分离时间缩短；
• 板高降低（柱效提高），分离时间缩短；
• 选择性因子增加，分离时间缩短；
• k=2时，分离时间最短；
• 流动相粘度小，分离时间缩短；
§3.5 分离度
作业 5 采用柱长为250cm的色谱柱分离 某混合物，死时间为1.20min， 各组分的保留时间与色谱峰底宽 如右图所示，试问：
k>10，R的改进不明显，反而使保留时间大为延长。1≤k≤10
§3.5 分离度
初始
R N ( 1) k2 4 1 k2
tR
k 增大
tR
改变 k 的方法： • ห้องสมุดไป่ตู้温（如GC） • 流动相性质和组成(LC中) • 相比β
② 塔板数 N （柱效）的影响
在等温条件下，k 和 为常数，R 决定于N，可由下式计算：
在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，
要达到完全分离，即R=1.5 。计算：①需要多少块有效塔板；
②若填充柱的有效塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？
解：①有效塔板
N eff
N ( k2 )2 1 k2
N 16R2 ( )2 (1 k2 )2 1 k2
N eff
16R2( )2 1
峰底宽重叠时，用半高峰宽代替峰底宽
R1/ 2
2(tR2 tR1 )
W W 1/ 2(2)
1/ 2(1)
若两峰底宽近似相等，W1≈W2，半高峰宽（R1/2）与峰底宽 （R）分离度的关系：
R1/ 2 W 4 1.699 R W1/ 2 2.354
分析实验员必备的四大板块知识
色谱分析法色谱法是一种分离分析方法。它利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同（吸附、分配、交换 等性能上的差异），先将它们分离，后按一定顺序检测各组分及其含量的方法。 2、色谱法的分离原理当混合物随 流动相流经色谱柱时，就会与柱中固定相发生作用（溶解、吸附等），由于混合物中各组分物理化学性质和结构上 的差异，与固定相发生作用的大小、强弱不同，在同一推动力作用下，各组分在固定相中的滞留时间不同，从而使 混合物中各组分按一定顺序从柱中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异，使混合物中各组分分离的技术， 称为色谱法。 3、流动相色谱分离过程中携带组分向前移动的物质。 4、固定相色谱分离过程中不移动的具有吸附 活性的固体或是涂渍在载体表面的液体。 5、色谱法的特点（1）分离效率高，复杂混合物，有机同系物、异构体。 （2）灵敏度高，可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快，一般在几分钟或 几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广，气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分 析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。(5)高选择性：对性质极为相似的组分有很强的分离能 力。不足之处：被分离组分的定性较为困难。 6、色谱分析法的分类按两相状态分类，按操作形式分类，按分离原 理分类。（1）按两相状态分类： 气相色谱(Gas Chromatography, GC)，液相色谱(Liquid Chromatography, LC)，超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 常用的气相色谱流动相有N2、H2、He等气体。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不 同又分为：气固色谱和气液色谱。液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液
凝胶渗透色谱的分离原理
凝胶渗透色谱的分离原理GPC的分离原理基于分子在凝胶（或称为透明凝胶）乃至分子筛中的渗透效应。
凝胶是由交联聚合物制成的多孔介质，具有指定的孔隙尺寸。
样品中的分子通过凝胶时，会受到凝胶孔隙大小的限制。
大分子无法进入较细的孔隙，只能在较大的孔隙中渗透；而小分子则可以进入更细小的孔隙。
通过选择合适的凝胶和溶液体系，可以实现对样品中分子进行逐一分离的目的。
GPC的实验操作通常包括三个步骤：样品注入、溶剂渗透和分离。
首先，样品以溶剂为载体被注入进GPC柱中。
溶剂和样品混合后，样品中的分子进入凝胶中。
然后，溶剂渗透或扩大凝胶孔隙，使分子在凝胶中进行渗透过程。
这个过程与液相色谱中与固定相的分离类似，会受到分子尺寸、形状以及溶剂的影响。
最后，分离出的分子按照尺寸从柱上逐一洗脱。
较大分子被阻碍在较小的孔隙中不能渗透，因此滞留时间较长；而较小分子则可以顺利通过较细小的孔隙，并更早地洗脱出来。
GPC主要根据聚合物的分子量进行分离，可以用于合成聚合物的分子量和分子量分布的测定。
此外，GPC还可用于测定天然高聚物（如蛋白质、多糖等）和大分子结构的分子量及其分布，对于探索高聚物分子结构与性质之间的关系具有重要意义。
通过GPC，可以得到分子量分布曲线，该曲线显示了样品中不同分子量的聚合物的相对含量。
通过分析GPC结果，可以对聚合物样品的分子量分布特征进行评估和比较。
GPC的分离原理的优点之一是可以在溶液中对样品进行分离，避免了其他技术中有机溶剂的使用。
此外，GPC适用于几乎所有类型的聚合物，包括天然和合成聚合物。
总之，凝胶渗透色谱是一种基于分子大小差异的高效分离技术，通过选择合适的凝胶和溶剂体系，可以实现对样品中分子的逐一分离，从而得到分子量和分子量分布的信息。
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a
b
c
图说明
• 凸形吸附等温线是液固系统中常见的一种，它反应 溶质分子在固体表面达到饱和时形成单分子层吸附。 • 凹形吸附等温线表示在低浓度下已吸附分子又能吸 附在液相中的分子，从而形成多分子吸附层。 • S形等温曲线实际上是凸形与凹形两种等温曲线叠 加的产物，它表示被吸附分子之间具有很长的作用 力，能进一步吸附其他分子，而溶质分子与固定相 表面的作用力相对较弱。
第四节
色谱分离的基本原理
色谱分离图示
色谱分离图示
一、分配色谱
• 利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的 分配系数不同而得以分离。
1、分配系数
• Kd = C1/C2
• K d为分配系数 • C1，C2为固定相与流动相中的溶质浓度。 • 应用条件：温度一定 • 低浓度
2、阻滞因数
• Rf=流动相（浓度中心）的移动速率/流动相在色 谱柱中的移动速率 =（r/R） • r—溶质（浓度中心）的移动距离 • R—在同一时间流动相（前缘）的移动距离 • 0≤Rf≤1，Rf值越大，溶质随流动相移动的速率就 越大，溶质被洗脱的速率也就越快。
据固定相 的形状不 纸色谱 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 同 薄层色谱 固定相在玻璃平板上铺成薄层
分类总结
分类原则 据流动相 的物态不 同 类型 气相色谱 特征 流动相为气体
液相色谱
流动相为液态
超临界流体 流动相为液态 色谱 将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力 迎头法(前沿 最弱的组分以纯粹状态最先流出，但其它各组分 分析法） 都不能达到分离。
（三）色谱分离理论上的不同
• 3、样品保留值与峰高不同
– 在分析色谱中，同一样品的保留值是一个常数，因而 可根据保留值的大小定性；色谱峰高与组分浓度呈线 性关系，因而峰高可作为定量分析的指标。但在制备 色谱和工业色谱中，保留值不仅随不同样品机时变， 而且随样品的浓度而变，因而不能根据保留值定性。 基于同样的原因，色谱的峰高也不能作为制备色谱和 工业色谱定性的指标。
第五节
柱色谱分离法
1、层析剂
• 含义：用于色谱分离技术中的固定相或分离介质。 由基质和表面活性官能团组成。
要求及种类
• • • • • • • • • 要求： （1）不溶于流动相 （2）化学稳定 （3）机械强度 （4）大的表面积 （5）粒度均匀 层析介质种类 无机（氧化铝，硅胶，活性碳） 有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）
3、塔板理论
• 理论塔板高度是指自这段柱中流出的液体和其中 固定相的平均浓度相平衡。
二、吸附色谱
• 根据吸附剂（固定相）对不同物质的吸附力不同 而使混合物分离的。 • 离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱， 前者主要是静电引力的作用，而后者是生物专一 亲和力的作用。
1、等温曲线
• 指一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附 过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲 线。 • Langmuir（朗谬尔）吸附等温曲线（凸形线）， 如图
按操作方 式不同
顶替法
利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质 来洗脱，这种物质称为顶替剂。此法处理量大， 且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组 分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的 一端，然后用溶剂洗脱，洗脱溶剂可以是原来溶 解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。
洗脱法
第三节
检测器与流分收集器
• 在线检测 • 流分收集器是将底部流出的液体，每次按一定量 分别收集的仪器，有滴数式、容量式、质量式， 其中后两种方便，故常用。
3、操作技术
• （1）样品溶解与进样方法 • 制备合适的样品溶液是成败的关键之一 • 活塞式进样
（2）展开操作
• 样品上柱后，加入洗脱剂，使样品分离并收集目 的产物，叫展开。 • 下面介绍几种方式：
纸层析小实验动画演示
第一节
概述
• 是一种物理分离方法，又称层析法、层离法等， 是利用不同组分物理化学性质的差别，使各组分 以不同程度分布在两个相中。其中一个为固定相， 一个为流动相。 • 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物 理化学性质的差别，而以不同的速率移动而进一 步分离的技术。
色谱的发展史
凝胶过滤
亲和色谱 疏水作用色谱
各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不 同
各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不 同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用 力不同
金属螯合色谱
共价作用色谱
分类总结
分类原则 类型 特征
低压色谱 操作压力小于0.5 MPa 中压色谱 操作压力在0.5～5 MPa之间 据实验技 高压色谱 操作压力在5～40 MPa之间 术 电泳 柱色谱 溶质分子在电场中的移动速度不同 固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱 中
1981
Jorgenson
创ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ了毛细管电泳法。
特点
• • • • • • • （1）分离效率高 （2）应用范围广 （3）选择性强 （4）高灵敏度的在线检测 （5）快速分离 （6）过程自动化操作 （7）适用于价格昂贵的产品
第二节
色谱法的分类
按分离机理不同分类
• • • • • • 5大类 1、吸附色谱分离 2、分配色谱 3、离子交换色谱 4、凝胶色谱（体积排阻色谱 ） 5、亲和色谱
洗脱剂浓度
体积或时间
B、前沿分析法
•
样品本身起流动相的作用。
A
•
A+B A+B+C
不能将样品中每个组分都分离回收，而只能得到 其中作用力最弱的纯物质。
C、置换展开法
• 又名顶替法或取代法。与洗脱展开法差别不大， 主要不同是样品输入色谱柱后，用一种与固定相 作用力极强的置换剂作为流动相。 • 最先流出的是作用力最弱的。 • 优点 • 缺点 取代剂
A、洗脱展开法
• 应用最广的一种方法。 • 先将样品输入柱，加 入一种或几种溶剂的 混合物作流动相洗。
物质浓度
流出液体积
又分三种
• 恒定洗脱法：不改变洗脱液的组成 • 逐次洗脱法：洗脱液的组成至少改变一次 • 梯度洗脱法：逐渐改变洗脱剂的组成
梯度洗脱装置
洗脱时梯度曲线的形状
• 洗脱液浓度与洗 脱液体积或洗脱 时间的关系曲线 称为梯度曲线。 • 通常先使用线性， 然后改变为凹形 或凸形。
• 可以看出1号氨基酸上升的最高，在 滤纸上跑得最快。 • 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因 此跑的速度比其他的氨基酸慢。
纸层析实验
甘氨酸
1
组氨酸
缬氨酸
半胱氨酸
2 3 4
这就是纸层析法。 • 对照上图，可知道1-4号的各代表 什么氨基酸。 • 纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基 酸组成的重要工具。
纸层析实验动画
原理图
洗脱方法——一般采用柱色谱法
• 两种： • 普通洗脱法和专一性洗脱法。
本章完
（三）色谱分离理论上的不同
• 1、理论塔板数的不同
– 对于生物小分子，分离机理比较明确，分离的好坏往往 与理论塔板数有明显的关系。但对于生物大分子而言， 色谱分离往往是多种分离机理的综合效果，分离的好坏 往往与理论塔板数没有明显的关系；
• 2、分配系数不同
– 在分析分配色谱中，样品中溶质的浓度较低，在一定温 度下，分配系数为常数，也即溶质在两相中的关系成线 性关系。在制备和工业色谱中，为了提高产率，必须提 高单元操作的进样量，也即样品的浓度往往很高。而在 高浓度溶质时，分配系数既是温度的函数，同时也是流 动相溶质浓度的函数。
第八章 色谱分离
Chromatographic Resolution, CR Chromatographic Analysis, CA(色谱分析)
纸层析实验
• 当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 • 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸 的混合物。 • 看看接下来会发生什么事情…
纸层析实验
1 2 3 4
年代 1906 1931 1938 1941 1952 1956 1957 1958 1965 1975 Golay Giddings Small 发明者 Tswett Kuhn, Lederer Martin, Synge Martin, James 发明的色谱方法或重要应用 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始 为人们所重视。 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作 为流动相（即气相色谱）。 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。
Taylor Uray 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。
Van Deemter 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 发明毛细管柱气相色谱。 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑 制型电导检测的新型离子色谱法。
分析色谱与制备色谱及工业 色谱的比较
（一）应用色谱技术应用范围的不同
• 分析色谱的流动相包括气相和液相，固定相形状 包括柱、纸和薄板，而制备和工业色谱主要是采 用以液相为流动相的柱上色谱。
（二）操作上的不同
• 在分析色谱中，进样量愈小愈好，检测灵敏度越 高越佳，因此出现了当今的微型毛细管柱色谱； • 在制备和工业色谱中，则要求进样量越多越好， 色谱柱也应适当大些，以可分离和纯化较多的产 品，从而出现了当今的大直径径向色谱柱 （Radial Flow Chromatographic Column， RFCC）。
生物工业中的色谱分离
色谱分离的规模
• • • • • • 4类： 色谱分析：<10mg 半制备：10~50mg 制备:0.1~10g 工业生产: >10g/d 色谱分离的规模小，但产值高。