水稻日本晴和93-11基因组参考序列的质量分析

３．１．１
９３．１１和中花１ｌ物理图谱与日本晴序列比对中的反向匹配末端序列……３０
３．１．２日本晴物理图谱与日本晴序列比对中的反向匹配末端序列………………３３ ３．１．３含有反向匹配末段的双末端ＢＡＣ克隆分析………………………………．３５ ３．１．４对于可能存在组装错误区段的序列分析和点阵图分析……………………３８ ３．１．５日本晴基因组序列中组装倒置错误的验证…………………………………４２ ３．１．６日本晴中得到验证的组装倒置错误的纠正…………………………………４４ ３．２日本晴基因组序列中空缺补缺资源的构建……………………………………．．４６ ３．２．１日本晴基因组序列中的空缺分析…………………………………………。４６
华中农业大学２０１３届博士研究生学位（毕…………………２１
２．１．３指纹分析及ＢＡＣ末端序列…………………………………………………．．２１
２．１．４水稻全基因组序列……………………………………………………………２１
２．１．５物理图谱资源…………………………………………………………………２２
２．４．４．２检测………………………………………………………………………………………………２６ ２．４．３镜检……………………………………………………………………………………………………．２６
２．５基因组参考序列与物理图谱的比对分析………………………………………．．２７ ２．６序列分析…………………………………………………………………………．．２７ ３结果与分析……………………………………………………………………………３０ ３．１日本晴全基因组序列中组装错误的检测与修正………………………………．．３０
ＩＵ
水稻日本晴和９３．１ｌ基因组参考序列的质量分析
摘要
对一个物种而言，完整的高质量的基因组序列是其广义研究中不可估量的宝贵 资源，并且是基因组学、基因功能、分子和进化研究的坚实基础，基因组参考序列的
质量在一定程度上也体现了该物种的研究进展和水平。水稻是重要的粮食作物，在
遗传学、分子生物学及基因组学研究中具有重要地位，同时也是第一个全基因组测 序的禾谷类作物。粳稻品种日本晴和籼稻品种９３．１１分别通过克隆连接克隆法 （ｃｌｏｎｅ．ｂｙ．ｃｌｏｎｅ）和全基因组鸟枪法（ＷＧＳ）进行了全基因组测序，其中日本晴参 考序列被公认为现有作物基因组序列中质量最高的，但其中仍然存在着组装错误和 空缺问题。 将９３．１１和中花１１物理图谱中ＢＡＣ末端序列与日本晴参考序列（ＩＲＧＳＰ
assembly水稻日本晴和931l基因组参考序列的质量分析缩略语表abbreviation11全基因组测序发展综述111全基因组测序的提出和重要性全基因组测序最早由dulbecco1986提出他认为破解人类基因组序列不仅能够让人类在分子层面加深对于自身的认识同时人类遗传信息的破译将有助于癌症治疗的相关研究
３．２．４覆盖日本晴基因组物理空缺的克隆的验证………………………………．．５５
３．３
９３．１１全基因组序列中存在的部分错误…………………………………………５７ ９３．１１和日本晴全基因组序列与９３．１ １物理图谱比对中有争议的ＢＡＣ克隆
３．３．１
…．．…．…．…．…．…．…．………．………．……．…．……．………．…．…．……．…．．……．…．…．．……．…．…．…．！；７ ３．３．２
ＡＢＳＴＲＡＣＴ………………………………………………………………………………………………………．ＩＩＩ
缩略语表…………………………………………………………………………………．Ｖ ｌ前言…………………………………………………………………………………………………………………１ １．１全基因组测序发展综述……………………………………………………………１ １．１．１全基因组测序的提出和重要性………………………………………………１ １．１．２基因组测序的常见方法………………………………………………………２
研究生躲讯
帆７．ｏｌ多年胆月７日
学位论文使用授权书
学位论文作者签名：砷去炙
签名日期－驯弓年月日
导师签名：
、乡兰～，尸
签名日期：Ｚ。；年矽７日
注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间
水稻日本晴和９３．１ｌ基因组参考序列的质量分析
目
摘
录
要……………………………………………………………………………………．．Ｉ
个日本晴序列空缺的ＢＡＣ克隆资源，这将为日本晴序列空缺的闭合提供宝贵信息和
资源。 我们将９３—１１物理图谱与９３—１ｌ和日本晴参考序列分别进行比对发现，比对结果 中存在很多在９３—１１和日本晴参考序列染色体定位上不一致的克隆重叠群。对部分
华中农业大学２０１３届博士研究生学位（毕业）论文
不一致克隆重叠群中的克隆进行ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
１．２
ＤＮＡ测序的方法发展……………………………………………………………．．３
１．２．１第一代测序方法………………………………………………………………３ １．２．２第二代测序方法………………………………………………………………４ １．２．３第三代测序方法………………………………………………………………５ １．３全基因组测序技术的发展…………………………………………………………６ １．４水稻研究的重要性…………………………………………………………………７
１．５水稻的分类和特点…………………………………………………………………９
１．６水稻全基因组测序的研究进展……………………………………………………９ １．６．１水稻全基因组测序的发展……………………………………………………９ １．６．２水稻全基因组测序存在的问题……………………………………………．．１２ １．６．２．１水稻基因组中序列中的空缺……………………………………………１２ １．６．２．２水稻基因组中序列中的组装错误………………………………………１２ １．６．２．３水稻基因组序列的测序质量……………………………………………１４ １．７高质量的全基因组序列在生物研究中的重要性………………………………．１５ １．７．１全基因组序列对功能基因组学研究的重要性……………………………．．１５ １．７．２全基因组序列对比较基因组学研究的重要性……………………………．．１６ １．８完善全基因组序列的方法和进展………………………………………………．１６ １．９本研究的目的和意义……………………………………………………………．．１９ ２材料与方法……………………………………………………………………………２１ ２．１实验材料…………………………………………………………………………．２１ ２．１．１植物材料……………………………………………………………………．．２１
４．４
９３．１１基因组序列中存在的组装错误……………………………………………６８
４．５总结…………………………………………………………………………………………………………．６８ 参考文献…………………………………………………………………………………７０ 附录…………………………………………………………………………………………………………………．．７９ 附录Ａ附表……………………………………………………………………………７９ 附录Ｂ简历…………………………………………………………………………．．９５ 论文发表和投稿情况……………………………………………………………………９６ 会议摘要…………………………………………………………………………………９７ 致谢………………………………………………………………………………………………………………．９８
分类号
华中农业大学博士学位论文
水稻日本晴和９３．１１基因组参考序列的质量分析
Ｑｕａｌｉｔｙ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｃｅ Ｎபைடு நூலகம்ｐｐｏｎｂａｒｅ ａｎｄ ９３．．１ １ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
博士研究生： 学 号：
邓颖
０８３０４０ １ ００２９
指导教师： 指导小组：
罗美中教授 熊立仲教授 张忠明教授 刘子铎教授 杨在清教授
列中序列组装
水稻日本晴和９３．１ｌ基因组参考序列的质量分析
和纠正。这种方法也能够被应用于改进其它基因组序列的组装质量。
日本晴基因组序列中的空缺问题同样制约了序列质量的提升。现有版本的日本 晴序列中仍然存在４５个空缺，其中９个是着丝粒序列，３６个是染色体臂物理空缺。 目前应对物理空缺还缺乏行之有效的闭合方法。我们利用实验室已有的水稻９３．１１、 珍汕９７、明恢６３和中花１ｌ四个品种的物理图谱，与日本晴参考序列进行比对定位， 找出物理图谱中可以覆盖日本晴参考序列空缺的克隆重叠群，并得到这些克隆重叠 群中可以覆盖或者桥接日本晴序列空缺的克隆。通过实验验证，得到了可以覆盖７
２．４．２ ２．４．３
ＢＡＣ克隆质粒提取……………………………………………………………２３
ＢＡＣ探针的制备………………………………………………………………２５
２．４．４荧光原位杂交实验……………………………………………………………２５ ２．４．４．１杂交……………………………………………………………………………………………２５
ｂｕｉｌｄ ５）
分别进行比对的结果发现，２８４和２５７个位置分别存在２个或２个以上反向匹配末 端。由此推测这些位置中可能存在日本晴序列中的倒置组装错误。为了排除不同品 种基因组差异的影响，我们将日本晴物理图谱中的ＢＡＣ末端序列与日本晴参考序列 进行比对。结果显示，３７１条ＢＥＳｓ呈两个或两个以上的组合反向匹配到日本晴基因 组序列上的１２３个位置。这些位置被我们视为潜在的倒置组装错误。对其中２７个含 有双末端匹配的位置进一步分析的结果表明，四个由反向重复序列导致的倒置组装 错误分别位于０４和１１号染色体上，在此基础上，我们对这些位置进行了实验验证
２．２
ＢＡＣ末端序列的比对分析………………………………………………………．２２
２．３基因组ＤＮＡ的提取………………………………………………………………２２
２．４水稻ＢＡＣ原位荧光杂交技术（ＢＡＣ—ＦＩＳＨ）……………………………………２３ ２．４．１染色体切片制备………………………………………………………………．２３
专业：生化与分子生物学 获得学位名称：理学博士
研究方向：植物基因组学 获得学位时间：
华中农业大学生命科学技术学院 二。一三年七月
华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书
学位论文 是否保密
委
如需保密，解密时间 独创性声明
年
月
日
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。
３．２．２
９３．１１、中花１１、珍汕９７、明恢６３物理图谱与日本晴序列比对…………４８
３．２．３不同水稻品种基因组比对分析中可以覆盖日本晴空缺的克隆和克隆群分
析…………………………………………………………………………………………………………………４９
ＩＩ
水稻日本晴和９３．１ｌ基因组参考序列的质量分析
Ｉｎ Ｓｉｔｕ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）分析发现，
这些不一致的区域是由９３．１ｌ基因组序列中的组装错误所导致。 综上所述，水稻粳稻和籼稻代表品种日本晴和９３．１１的基因组测序虽然早己完 成，但序列的完善工作仍然任重而道远。本研究提出了一种新的用于检测与纠正序 列中组装错误的方法，而该方法也可用于提高其它基因组序列的质量。通过比对分 析，本研究构建了闭合日本晴序列空缺的相关资源，并验证了部分９３．１１基因组序
９３．１１物理图谱与日本晴和９３．１１全基因组序列比对中有争议的ＢＡＣ克隆
在９３．１１中的核型定位……………………………………………………………．６０ ４讨论………………………………………………………………………………………………………………．６４ ４．１日本晴全基因组序列中组装错误产生的原因和类型分析……………………．６４ ４．２日本晴基因组序列中存在的潜在的拼装错误…………………………………．６６ ４．３日本晴基因组序列中空缺的闭合资源…………………………………………．６７