苏州大学基因工程(02级生物技术专业)试题(B卷)

苏州大学基因工程（02级生物技术专业）试题（B卷）
（2005.12）
姓名学号得分
一名词解释（4分/题，共20分）
1．假基因在珠蛋白基因簇（gene cluster）各片断核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片断，它不能行使表达功能。

该类无表达功能的畸变核苷酸序列片断，称为假基因。

2．亮氨酸拉链亮氨酸拉链（Leucine zipper,LZ）: AP-1,for,jun等DBP具有亮氨酸拉链, 在蛋白质C末端约有30个氨基酸组成, 为两组走向平行、带亮氨酸的α-螺旋形成的对称二聚体。

每2个亮氨酸之间相隔6个氨基酸。

这样在α-螺旋的每2圈（个氨基酸残基为一个螺旋圈）就出现一个亮氨酸, 排成一排, 使2个α-螺旋的蛋白分子之间形成一条拉链（如图7-2）。

形成二聚体后可使肽链上富含的碱
性氨基酸区与亮氨酸拉链形成的整体结构与DNA亲和力较强而发生结合。

3．多价疫苗其原理是将外源性目的基因(保护性抗原基因)插入已知的病毒或细菌的弱毒株或疫苗株的基因组中至使目的基因获高效表达，但不影响原弱毒株或疫苗株的生存与繁殖。

接种了这种重组疫苗以后，体内除了可获得针对原疫苗株的免疫保护之外，还可获得插入目的基因对相关疾病的保护力，目前应用最多的载体为以牛痘苗病毒为载体同时插入和表达了多种病毒的保护性抗原基因，如HAV、HBV，麻疹病毒，Ⅰ型和Ⅱ型HSV、EBV、狂犬病毒等。

4．双特异性抗体两抗体的重链和轻链基因的重组体导入宿主细胞中表达，或用肽链连接物连接两种不同特异性抗体的可变区基因，构建单肽双特异性抗体。

如：将抗肿瘤细胞EGFR的Fab与抗T细胞CD3的Fab组成双特异性抗体，有助于介导T细胞杀肿瘤（连接效-靶细胞）
5．基因修饰指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。

（4）基因失活(gene inactivation)就是应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制某些有害基因的表达。

二填空题（3分/题，共15分）
1. 质粒分离纯化后，经琼脂糖电泳后常有三条带，它们分别为超螺旋、开环双螺旋、线状双螺旋。

2.λ噬菌体的CI蛋白基因插入外源性基因的克隆为清晰的噬菌斑，未插入外源性基因的克
隆为浑浊的噬菌斑。

3. 理想的质粒克隆载体应具备以下基本条件，如能自主复制、一种或多种限制酶的酶切位点、筛选标记、分子量小易拷贝。

4. 点突变的基因系列在碱基替换中，若为一个嘌呤换成另一个嘌呤或一个嘧啶换成另一个嘧啶者称转换，若一个嘌呤换成一个嘧啶或一个嘧啶换成一个嘌呤者称颠换。

5. 基因表达的四大表达系统分别为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞。

三是非判断题（2分/题，共10分）
1. 甲基化酶能使DNA序列发生甲基化，早基化DNA的更为稳定，被甲基化的酶切点，不易被酶切割。

（√）
2. S1酶具有补平DNA链粘性末端的特性。

（X ）
3．COS位点，COS质粒都含有用于载体自身环化的12个碱基的互补粘性末端。

（√）
4. cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。

（X ）
5. 原核细胞的RNA聚合酶只能识别原核细胞的启动子以催化RNA的合成。

（X ）
四．不定项选择题（3分/题，共15分）
1. 原核细胞基因表达的特点为( BC )
A.单顺反子
B.多顺反子
C.转录和转译连续进行 D .转录和转译分开分步进行
2. DNA连接酶的功能是( AB )
’-OH与5’-P之间的磷酸二酯键 B. 恢复缺口
3. 下列哪些启动子可由乳糖或IPTG诱导表达( AC )
A Lac启动子
B Trp启动子
C Tac启动子
D Lpp启动子
4. 真核细胞筛选阳性克隆的遗传标记（报告基因）( CD )
A Amp r
B Tet r
C neo r
D TK
E LacZ
5. PUC质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件( A B C D )
r
五问答题（8分/题，共40分）
1将外源性DNA克隆到 -LacZ区段的插入型噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？
β-半乳糖苷酶失活的插入型载体，在其基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ区段，此区段编码有β-半乳糖苷酶基因lacZ，在诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）存在下，β-半乳糖苷酶能作用X-gal(5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷)形成蓝色化合物（5-溴-4-氯靛蓝）。

这样由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌（lac基因缺陷菌），涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬斑，但若在lacZ区段上插入外源DNA片段，就会阻断β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，这种λ重组体感染的lac-指示菌由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑，相反未发生外源基因插入则出现蓝色噬菌斑，以利筛选。

2基因与载体的平末端连接方法有哪些？简要或图示说明均可。

（1）T4DNA连接酶法
连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。

T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA 连接酶不同。

T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。

（2）同聚物加尾法
运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH 基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。

3如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因的存在和正确性？
根据插入基因的遗传性状进行筛选
只有当已知需克隆基因所编码蛋白质的功能, 且该蛋白质又为细菌的生命活动所必需时, 即可用该方法筛选。

如：已知蛋白质中的亮氨酸（Leu）为Leu营养缺陷菌所必需, 当外源目的基因可表达亮氨酸, 将该基因的重组子转入Leu缺陷菌中, 在不含亮氨酸的基本培养基平板中, 只有重组子表达的亮氨酸才能被Leu缺陷菌所利用而能生长繁殖,形成菌落。

因而能生长的细菌集落，均为阳性的重组子克隆，而无该重组子的Leu缺陷菌在不含亮氨酸的平板上则不能生长，不能形成菌落。

根据重组子的结构特征筛选
(1). 重组子大小鉴别筛选
重组子中因装有一段较大分子量的外源基因DNA, 因此其分子量明显比原载体大得多, 因此可从平板上挑取菌落分别提取重组载体（如质粒重组子）和原载体（质粒），无需用限制性内切酶消化，直接进行凝胶电泳，携带外源性目的基因的重组子质粒因分子量大，电泳迁移率较小，其电泳条带在后，而原载体质粒因分子量较小，电泳迁移率较大，其电泳条带在前。

通过比较可初步判断重组子中是否
插入外源基因片段。

本方法适用于插入片段较大的重组子的初步筛选。

(2). 酶切鉴定
对于筛选出的具有重组子的菌株，应经小量培养后，再分别提取原载体或重组体载体（重组质粒或重组噬菌体DNA），根据已知重组时外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，原载体因无外源性目的基因，切开后变成线性，电泳呈一条带，若载体上有外源性目的基因插入，切开后电泳出现两条带：一条为载体质粒线性条带，一条为释放出的插入基因片断的小分子条带，这样就可以看出载体中是否有插入的目的基因片断，以及由DNA marker 条带对比分析可得知插入基因片段的大小
(3).目的基因序列测定
4 真核表达调控的反式作用因子有哪些？其作用特点是什么？
反式作用因子种类多，大多数有DNA序列结合特异性, 如识别TATAbox的DBP为TF ⅡD, 可与RNA聚合酶Ⅱ结合而起转录起始作用; 识别GCbox的DBP为SP1, 可调控转录效率，这些都是通用转录因子。

其中有些DBP则具有组织特异性, 目前发现反式作用因子有如下主要作用规律：⑴同一DNA序列可被不同蛋白质识别; ⑵同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系, 但属于直接结合的仅为少数, 多数是蛋白质－蛋白质先互相结合, 然后再影响DNA；⑶蛋白质－蛋白质或DNA－蛋白质的结合, 均导致构象上的细微变化, 构象变化常是实现调控功能的分子基础；⑷在反式作用因子的自身生物合成过程中，有相当大的可变性和可塑性。

反式作用因子都有与顺式作用元件特定的DNA序列结合的特定结构域。

该特定结构域有两种：①通用转录因子的结构域，为识别结合特异DNA序列的DNA结合结构域（如：锌指结构、亮氨酸拉链、螺旋－转角－螺旋、螺旋－环－螺旋）；②转录调节因子的结构域，又称转录活化结构域（如酸性α－螺旋结构域、富含谷氨酰胺结构域、富含脯氨酸结构域）。

有些DBP只有两个氨基酸残基, 不同的结构域均有自己的特征性结构。

5 目的基因的改造常用的技术手段有哪些？举例说明之。

(1)采用点突变技术，如将IFN的cDNA中某个或某几个氨基酸编码子采用点突变技术使之人为地发生改变，而使IFN中的原来氨基酸突变后被表达的新氨基酸所取代，从而产生新型干扰素，[称为IFNs“类似物”(anatognes)]，就新型IFN-β来说，在141位由Try(色氨酸)替代了Cys(半胱氨酸)或IFN-β第17位的半胱氨酸酸编码子TGT变成AGT而被丝氨酸所取代，进而产生了IFN-βser17，不仅使抗病毒活性发生了明显改变，而且稳定性也有很大变化。

肿瘤坏死因子(TNF)原型毒性太大，难以用于人体治疗肿瘤，采用点突变后的TNF衍生物仍保留原有的杀肿瘤生物学特性，但毒性大大降低。

我国已研究成功，并正在作为Ⅰ类新药上临床。

人白细胞介素-2(IL-2)由于有游离二硫键存在复性错配问题，而使其产品不稳定，难以运输和长期保存，采用点突变后获得了耐热的IL-2突变体，解决了IL-2的稳定性问题(刘新恒研制成功)。

(2)基因拼接：将有共同限制性内切酶切点的基
因连接起来形成多种基因杂合体。

如将IFN-α1与IFN-α2亚型间进行拼接，可形成IFN-α1/α2或IFN-α1/α1，或IFN-2A/α1及IFNα1/2A，这种IFN亚型间基因拼接所形成的杂合体称为IFNs“杂合体”(hybrids)或称“类IFN-S”，除此而外也可根据需要将具有协同效应的不同基因进行接拼，如IFN-TNF或IL-3-G-CSF，分别可增强TNF或G-CSF生物学效应。

(3)缺失：将原基因中的非功能区域的编码子人为地使之缺失，所表达的产物分子量虽然小了，但有时可提高表达效率(如IL-6缺失N端17-25个核苷酸可使IL-6的表达效率明显提高)，有时还可降低一些毒性作用，如TNF基因缺失某一区域可使毒性下降。