DNA聚合酶-Taq酶

3. DNA聚合酶-Taq酶
Taq酶- DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。

(一)DNA聚合酶活性与热稳定性
该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA 聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR 循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性，实验表明.PCR 反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA 聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.
(二)DNA聚合酶离子依赖性
aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在10mmol/L 时可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性.
(三)忠实性
TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，而无3’→5’外切活性，它不具有Klenow酶的3’→5’校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的.Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4.
(四)抑制剂
低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的催化活性并无影响.极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷基肌氨酸钠(小于0.02%)，十二烷基硫酸钠(SDS，小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性.而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40.和Tritox-100)如>5%时方能抑制该酶的活性.
低浓度的NP-40(0.05%)和Tween20(0.05%)能增强TaqDNA聚合酶的活性.低浓度SDS
对该酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消.TaqDNA聚合酶可在-20℃贮存至少6个月.。