HPLC-FL检测GSH-确定实验方法

HPLC-FL（OPA法）
1.原理：谷胱甘肽在pH8的碱性条件下，与邻苯二甲醛作用形成1:1的络合物，
该络合物在紫外光照射下会发生蓝色荧光，然后用荧光分光光度仪进行测定。

2.试剂：
HCl溶液（1mM）：0.85g盐酸溶液溶于1L水中。

GSH工作液（1mM）：现用现配，取0.0307gGSH溶于100mL的1mM盐酸中，4℃保存(Kand’ár, Žáková, Lotková, Kučera, & Červinková, 2007)。

OPA溶液（0.1% w/v）：取0.1gOPA溶于100mL甲醇中。

NEM溶液（40mM）：
NaOH（pH12）：0.1M。

磷酸缓冲液（pH8）：分别取94.7mL的Na2HPO4▪12H2O（0.2M，71.64g/L水）和5.3mL的NaH2PO4▪2H2O（0.2M，31.21g/L水）溶液。

流动相：甲醇和25mM的Na2HPO4▪12H2O溶液（8.96g溶剂溶于1L水，磷酸调pH6）（15:85）
3.GSH衍生方法（略做调整）：100μL的样品+1.8mL磷酸缓冲液（pH8）+100μL
OPT溶液。

混合震荡，25℃，避光孵化15min(Hissin & Hilf, 1976)，过膜后4℃贮存。

4.GSSG衍生方法：100μL的样品+100μL的NEM溶液，25℃避光反应25min。

取
100μL的以上反应物+1.8mLNaOH（pH12）+100μL OPT溶液。

混合震荡，25℃，避光孵化15min
5.液相条件(略做调整)：C18柱；37℃；流动相为甲醇和25mM的Na2HPO4▪12H2O
溶液15:85；0.5mL/min；14min。

(Kand’ár, Žáková, Lotková, Kučera, & Červinková, 2007)
6.检测条件：荧光检测器，激发波长350nm，发射波长420nm
7.GSH提取（略做调整）：加入20mL OPA（0.1%）衍生化试剂的0.02mol/L磷
酸盐缓冲溶液，超声波清洗仪振荡40min，抽滤，取上清液。

取10mL上清液，加入2倍体积乙醇，放置30min，在8000r/min离心除蛋白5min，取上清液作为光谱测定供试品。

测定时取1mL样品加入磷酸盐缓冲液缓冲液定容至10mL 作为测试液。

(朴玉莲, 沈丽, 韩玲, & 崔胜云, 2012)
8.GSH提取：精确称取0.2g面粉，置于10mL离心管中，加入5%的冰高氯酸溶
液2mL（氮吹除氧），密封低温超声震荡40min，29000gmax, 4℃离心10 min，取1mL上清液衍生。

(Schofield & Chen, 1995)
Hissin, P. J., & Hilf, R. (1976). A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues. Analytical biochemistry, 74(1), 214-226.
Kand’ár, R., Žáková, P., Lotková, H., Kučera, O., & Červinková, Z. (2007). Determination of reduced and oxidized glutathione in biological samples using liquid chromatography with fluorimetric
detection. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 43(4), 1382-1387. Schofield, J., & Chen, X. (1995). Analysis of free reduced and free oxidised glutathione in wheat flour.
Journal of Cereal Science, 21(2), 127-136.
Squellerio, I., Caruso, D., Porro, B., Veglia, F., Tremoli, E., & Cavalca, V. (2012). Direc t glutathione quantification in human blood by LC–MS/MS: comparison with HPLC with electrochemical
detection. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 71(0), 111-118.
朴玉莲, 沈丽, 韩玲, & 崔胜云. (2012). 衍生化法测定水果中还原型谷胱甘肽(GSH) 和总巯基含量. 食品工业科技, 33(020), 60-64.。