用于预防和治疗神经变性疾病的三白草提取物[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1394143A [43]公开日2003年1月29日
[21]申请号01803218.4[21]申请号01803218.4
[22]申请日2001.10.19[30]优先权
[32]2000.10.19 [33]KR [31]2000/61687
[32]2000.10.19 [33]KR [31]2000/61688
[86]国际申请PCT/KR01/01766 2001.10.19
[87]国际公布WO02/32443 EN 2002.04.25
[85]进入国家阶段日期2002.06.19[71]申请人艾尔康姆生物技术株式会社
地址韩国汉城
[72]发明人金荣中 成相泫 S·R·金
[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所代理人李华英
[51]Int.CI 7A61K 35/78
权利要求书 2 页 说明书 22 页 附图 1 页
[54]发明名称
用于预防和治疗神经变性疾病的三白草提取物
[57]摘要
本发明涉及预防和治疗神经变性疾病的三白草
提取物以及含有三白草提取物或从其中分离的土青
木香内酰胺生物碱衍生物的药物制剂。

01803218.4权 利 要 求 书第1/2页
1、用于预防和治疗神经变性紊乱的三白草提取物，其中三白草从有机溶剂提取并将溶剂除去。

2、用于预防和治疗神经变性紊乱的药物制剂，含有三白草提取物作为主要组份以及制备药物制剂的载体。

3、通式(I)的化合物用于预防和治疗神经变性紊乱的用途：
其中R1和R2各自是H、C1-4低级烷基或下面的基团
(其中R5是H或C1-4低级烷基，R6是H、OH或C1-4低级烷基)，R3是H
或C1-4低级烷基。

4、用于预防和治疗神经变性紊乱的药物制剂，含有通式(I)的化合物作为活性组份以及制备药物制剂的载体：
其中R和R各自是H、C低级烷基或下面的基团
01803218.4权 利 要 求 书 第2/2页
(其中R5是H或C1-4低级烷基，R6是H、OH或C1-4低级烷基)，R3是H 或C1-4低级烷基。

01803218.4说 明 书第1/22页用于预防和治疗神经变性疾病的三白草提取物
技术领域
本发明涉及具有预防和治疗神经变性紊乱的提取物以及含有这种提取物作为活性组份的药物制剂。

本发明还涉及以下通式(I)的化合物用于预防和治疗神经变性紊乱的用途
其中R1和R2各自是H、C1-4低级烷基或下面的基团
(其中R5是H或C1-4低级烷基，R6是H、O H或C1-4低级烷基)，R3是H 或C1-4低级烷基。

技术背景
最近，患神经变性紊乱的患者伴随老年人群的增加平行地快速增加。

典型的神经变性疾病是阿尔茨海默病。

阿尔茨海默病的主要症状是记忆损失并且学习能力下降。

除了患者之外给家庭也带来麻烦。

因此，它成为社会问题。

对预防和治疗阿尔茨海默病的兴趣日益增加。

此外，尽管
人疾病的发生也增加。

例如作为中风的继发性症状的神经变性紊乱的发生也增加。

尽管这些起源于各种原因的神经变性紊乱的发生增加，但是至今没有开发出能够有效地预防和治疗这些紊乱的药物。

可以由于脑震荡和老化、如循环紊乱的继发症状和各种物理或机械因素如交通事故、操作事故、一氧化碳中毒引起的神经变性紊乱产生该神经变性疾病(R o t h m a n S.M.(1984)S y n a p t i c r e l e a s e o f e x c i t a t o r y a m i n o a c i d neurotransmitter mediates anoxic neuronal death.J.Neurosci.4：1884-1891；和W e i l o c h，T.(1985)H y p o g l y c e m i a-i n d u c e d n e u r o n a l damage prevented by an NMDA antagonists.Science 230：681-683)。

由于上面的原因，当流入大脑的血液降低或中断时，脑组织缺氧或者葡萄糖低。

然后大脑不能进行正常的代谢并且变成不可逆地损伤。

这些情况经常可以在中风、创伤、局部出血损伤和神经变性紊乱中看到。

(Benveniste，H.，Drejer，J.，Schousboe，A.and Diemer，N.H.(1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia m o n i t o r e d b y i n t r a c e r e b r a l m i c r o d i a l y s i s.J.N e u r o c h e m.43：1369-1374 and Hagberg，H.，Lehmann，A.，Saucberg，M.，Nystrom，B.，J a c o b s o n，I.a n d H a m b e r g e r，A.(1985)I s c h e m i a-i n d u c e d s h i f t o f inhibitory and excitatory amino acids from intra-to extracellular compartments.J.Cereb.Blood Flow & Metab.5：413-419)。

脑组织受损大多数分为两种机理。

一种是因为基于细胞膜电压改变的游离兴奋性氨基酸的增加。

另一种是因为直接氧化应力(C h o i，D.W. (1988)Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system. N e u r o n 1：623-634；和C o y l e，J.T.和P u r r f a r c k e n，P.(1993) Oxidative stress，glutamate and neurodegenerative disorders.《科学》(S c i e n c e)262：689-695)。

根据最近研究，谷氨酸盐被认为是通过激活变力性受体而发生氧化应力的根源物质。

因此，谷氨酸盐被认为是发生中风、创伤、局部出血损伤的根源。

(Halliwell，B and Gutteridge J.M.(1985a)O x y g e n r a d i c a l s a n d t h e n e r v o u s s y s t e m.T r e n d s
Neurosci.5：22-26 and Halliwell，B and Gutteridge J.M.(1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human d i s e a s e s.M o l.A s p e c t s M e d.8：89-193)。

当大脑血流降低时，突触谷氨酸盐释放增加，并且流入神经元的谷氨酸盐降低。

因此，细胞外的谷氨酸盐浓度快速增加。

最后，神经元死亡。

(Benveniste，H.，Drejer，J.，Schousboe，A.and Diemer，N.H.(1984)Elevation of the
extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat
h i p p o c a m p u s d u r i n g t r a n s i e n t c e r e b r a l i s c h e m i a m o n i t o r e d b y
i n t r a c e r e b r a l m i c r o d i a l y s i s.J.N e u r o c h e m.43：1369-1374 a n d Hagberg，H.，Lehmann，A.，Saucberg，M.，Nystrom，B.，Jacobson，I. and Hamberger，A.(1985)Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra-to extracellular compartments. J.C e r e b.B l o o d F l o w & M e t a b.5：413-419)。

这种基于谷氨酸盐的神经毒性分成显示毒性强且快的“急性毒性”和神经元暴露于低浓度谷氨酸盐或者在高浓度谷氨酸盐下暴露短时间的“慢性毒性”(C h o i，D.W. (1988)Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system.) N e u r o n 1：623-634)。

当存在于细胞外的C a2+过量流入细胞中并且为了保持渗透压，例如N a+、K+和C l-的离子流入细胞，并且细胞突然死亡时开始急性毒性。

(K a u p p i s e n，R.A.，M c M a h o n m，H.T.a n d N i c h o l l s，D.G. (1988)C a2+-d e p e n d e n t a n d C a2+-i n d e p e n d e n t g l u t a m a t e r e l e a s e，energy status and cytosolic free Ca2+concentration in isolated n e r v e t e r m i n a l s f o l l o w i n g m e t a b o l i c i n h i b i t i o n：P o s s i b l e relevance to hypoglycemia and anoxia，Neurosci.27：175-182 and G a r t h w a i t e，G.a n d G a r t h w a i t e，J.(1988)I n v i t r o n e u r o t o x i c i t y of excitatory acid analogues during cerebellar development，J. Neurosci.17：755-767)。

当N-甲基-D-天冬氨酸(N M D A)、谷氨酸盐受体和非-N M D A被激活并且C a2+流入细胞并通过该C a2+-依赖性酶被激活，最终细胞死亡时开始慢性毒性。

(C o y l e，J.T.和P u r r f a r c k e n，P.(1993)O x i d a t i v e s t r e s s，
glutamate and neurodegenerative disorders.Science 262：689-695)。

即，随着N M D A和非-N M D A被谷氨酸盐激活，C a2+流入细胞并且磷脂酶A2，该C a2+-依赖性酶被异常激活，多自由脂肪酸的形成增加，因此，例如活性氧和/或活性过氧化氢的自由基异常地增加并且加速了细胞的过氧化作用，最后细胞死亡。

(Coyle，J.T.和Purrfarcken，P.(1993)
Oxidative stress，glutamate and neurodegenerative disorders. Science 262：689-695；Halliwell，B and Gutteridge J.M.(1985a) Oxygen radicals and the nervous system.Trends Neurosci.5：22-26；Halliwell，B and Gutteridge J.M.(1985b)The importance of ftee radicals and catalytic metal ions in human diseases.Mol.Aspects Med.8：89-193；Siejo，B.K.and Wieloch，J.(1985)Cerebral
metabolism in ischaemia：neurochemical basis for therapy.Br.J. Anaeth.47：47-62；Sladeczek.F.，Pin.J.P.，Recasens，M.，Bokaerk，J.a n d W e i s s，S.(1985)G l u t a m a t e s t i m u l a t e s i n o c i t o l p h o s p h a t e formation in striatal neurones，Nature 317：717-719和Choi，D.W. and Koh，J.(1987)Ionic dependence of glutamate neurotoxicity. J.N e u r o s c i.7：369-279)。

当N M D A受体被激活时，一氧化氮合成酶的活性增加并且过量形成一氧化氮。

由此形成的一氧化氮也增加了细胞的过氧化作用。

(Strijbos P.J.L.M.，Leach M.J.和Garthwaite J.(1996) Vicious cycle involving Na+channels.glutamate release and NMDA receptors mediates delayed neurodegenerat ion through nitric oxide f o r m a t i o n.J.N e u r o s c i.16：5004-5013)。

神经毒性可以通过谷氨酸盐的拮抗剂，钠-或钙-通道阻断剂，抗氧化剂、自由基阻断剂和抑制从黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶的抗蛋白酶来预防。

特别是抗N M D A受体的拮抗剂是有效的。

(C h o i，D.W.，K o h，J.a n d P e t e r s，S.(1988) Pharmacology of glutamate neurotoxicity in cortical cell culture：attenuation by NMDA antagonists.J.Neurosci.8：185-196 and Olney，J.W.a n d S h a r p e，I.G.(1969)B r a i n l e s i o n s i n a n i n f a n t r h e s u s monkey treated with monsodium glutamate.Science 166：368-388)。

为了开发阿尔茨海默病、引起胸腺功能缺失的重要疾病的药物，直接研究定位于这二者。

即，当为谷氨酸盐(g l u t a m a t e)神经元时，功能被强化(使用有效药物)或者功能得到抑制(使用拮抗剂)。

即，当通过损伤谷氨酸盐神经元降低谷氨酸盐含量时，记忆和学习能力降低。

当为阿尔茨海默病的患者时，N M D A受体、谷氨酸盐受体的量降低至N M D A受体的75-87％和非-NMDA受体的45-69％。

(Cowburn，R.，Hardy，J.，Roberts，P.and Briggs，R.(1988)Regional distribution of pre-and
postsynaptic glutamatergic function in Alzheimer’s disease.Brain R e s.452：403-407 G r e e n a m y r e，J.T.，P e n n e y，J.B.，D’A m a t o，C. J.and Young A.B.(1987)Dementia of the Alzheimer’s type：Changes i n h i p p o c a m p a l L-[3H]g l u t a m a t e b i n d i n g，.J.N e u r o c h e m.48：543-551 and Chalmers，D.T.，Dewar，D.，Graham，D.I.，Brooks，D. N.and McCulloch，J.(1990)Differential alternations of cortical glutamatergic binding sites in senile dementia of the Alzheimer t y p e.P r o c.N a t l.A c a d.S c i.U S A 87：1352-1356)。

并且谷氨酸盐受体在已知为与记忆和学习能力有关的大脑区浓缩。

所以记忆损失和学习能力降低被认为是受谷氨酸盐受体的异常的影响。

(I z q u i e r d o，I.(1991) Role of NMDA receptors in memory.Trends Pharm.Sci.12：260-265)。

记忆和学习时，当钙离子增加并且蛋白溶解酶被激活时，谷氨酸盐受体增加。

结果，突触的结构和化学改变上升并且人可以记忆和学习。

这是最可能的假设。

(Thompson，R.F.(1986)The neurobiology of learning a n d m e m o r y.S c i e n c e 233：941-947)。

阿尔茨海默病的重要症状是记忆损失。

已知谷氨酸盐的有效药物在记忆和学习能力方面具有重要作用。

研究通过给予有效的谷氨酸盐药物，有效的药物可用于治疗记忆损失。

一些有效药物具有功效。

(W i l l e t t s，J.，B a l s t e r，R.L.，L e a n d e r，J.
D.(1990)The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci 11：423-428)。

然而，在阿尔茨海默病的患者中，大脑和海马皮层的神经突触前末端的谷氨酸盐的重吸附不能和谐地(h a m o n i o u s l y)进行。

代谢谷氨酸盐和合成G A B A的脱羧酶的含量降低，
结果突触的谷氨酸盐的含量增加。

(W i l l e t t s，J.，B a l s t e r，R.L.，Leander，J.D.(1990)The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists.Trends Pharmacol Sci 11：423-428)。

以上面的文献和考虑为基础，本发明人使用原代培养大鼠皮层细胞引用已知具有抗神经变性紊乱如中风或记忆缺乏的效果的中药或原料药物的影响。

将总甲醇提取物给予原代培养大鼠皮层细胞并给予大量谷氨酸盐，试图了解该提取物对神经元死亡的影响。

结果，我们发现三白草的总甲醇提取物对神经保护活性具有显著影响。

此外，从三白草分离出来的土青木香内酰胺(a r i s t o l a c t a m)衍生物的生物碱具有显著的神经保护活性。

三白草是属于三白草属(S a u r u r a c e a e)的多年生植物。

在民间已将整个植物、根或叶用作抗利尿、水肿、淋病、肝炎、肺炎、高血压的治疗药物。

对三白草组份的研究主要集中在茎和叶中的类黄酮、生物碱、氨基酸、脂肪酸、醌、精油。

作为全植物的精油，报道了甲基正壬基酮。

此外，报道了α-蒎烯、莰烯、黄樟脑、β-c a r o p h y l l e n e、芳樟醇和葎草烯(Choe，K.H.，Yoon，C.H.and Kwon，S.J.(1988b)Chemical
composition of Saururaceae growing in Korea-on volatile
constituents of Saururus chinensis by GC/MS.Punsok kwahak 1：259-262 a n d C h o e，K.H.，K w o n，S.J.a n d L e e K.C.(1989)C h e m i c a l composition of Saururaceae growing in Korea-on fatty acids and amino acids of Houttuynia cordata and Saururus chinensis.Punsok k w a h a k 2：285-288)。

作为茎和叶的主要成分的类黄酮，报道了金丝桃苷、槲皮素、异槲皮素和栎苷。

(C h o e，K.H.，Y o o n，C.H.a n d K w o n，S.J.(1994)A s t u d y o f c h e m i c a l c o n s t i t u e n t s o f S a u r u r a c e a e growing in Korea-on flavonoid constituents of Saururus chinensis.
A n a l.S c i.T e c h n o l.7：11-15 S u n g，S.H.，K w o n，S.H.，C h o，N.J.
a n d K i m，Y.C.(1997)H e p a t o p r o t e c t i v e f l a v o n o l g l y c o s i d e s o f Saururus chinensis Herbs.Phytotherapy Res.11：500-503 and Wang，
E.C.，S h i h，M.H.，L i u，M.C.，C h e n，M.T.a n d L e e，G.H.(1996) Studies on constituents of Saururus chienesis，Heterocycles 43：969-972)。

报道了例如大黄素、大黄素甲醚和例如c a r p a n o n e的木脂体的醌系列组份。

(Crohare，R.，Priestap，H.A.，Farina，M.，Cedola，M.and Ruveda，E.A.(1962)Aristolactams of aristolochia argenlina. Phytochemistry 13：1957-1960)。

此外，分离三白草内酰胺
(s a u r o l a c t a m)(土青木香内酰胺系列生物碱)作为细胞毒性组份。

(Priestap，H.A.(1989)13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams.Magn.Reson.Chem.27：460-465)。

也报道了相同系列的生物碱-土青木香内酰胺。

(C r o h a r e，R.，P r i e s t a p，H.A.，F a r i n a，M.，C e d o l a，M.a n d R u v e d a，E.A.(1962) A r i s t o l a c t a m s o f A r i s t o l o c h i a a r g e n t i n a.P h y t o c h e m i s t r y 13：1957-1960)。

此外，还报道了例如铜酸(I I)、亚油酸和月桂酸的脂肪酸，例如丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸的氨基酸。

(P r i e s t a p，H.A.(1985a)S e v e n a r i s t o l a c t a m s f r o m Aristolochia argentina.Phytochemstry 24：849-852)。

本发明所要解决的技术内容
本发明人已研究了三白草提取物和从该提取物中分离出来的物质，并发现了以下事实。

因此，本发明的一个目的是提供一种预防和治疗神经变性紊乱的含有三白草提取物作为活性组份的药物制品。

本发明的其它目的是提供通式(I)的化合物用于预防和治疗神经变性紊乱的用途。

本发明的另一目的是提供一种预防和治疗神经变性紊乱的含有通式(I)的化合物作为活性组份的药物制品。

附图简述
图1是显示了分离三白草内酰胺-3-O-(E)-对甲氧基肉桂酸酯对处理前或后处理谷氨酸盐损伤的大鼠皮层细胞的过氧化物含量的影响。

发明构成
下面详细解释本发明的构成和效果。

在低级醇例如甲醇、乙醇或丙醇、氯代烃如二氯甲烷或氯仿、烃如己烷或庚烷、和芳香烃如苯或甲苯、或其混合物中进行三白草的提取。

通过以下实施例和试验实施例详细解释本发明。

实施例1
在回流设备中将干三白草(10k g)用C H C l3-M e O H(1∶1)提取3次，通过真空除去溶剂获得三白草总提取物(1.8k g)。

将该提取物悬浮于水中并用C H2C l2提取。

将该C H2C l2提取物真空蒸发至干。

将所得C H2C l2馏分悬浮于90％M e O H并用正己烷提取。

将正己烷提取物和残余90％M e O H悬液真空干燥，分别获得60g正己烷馏分和120.0g的90％MeOH馏分。

实施例2
化合物1的分离和鉴定
将所述正己烷馏分(60g)层析于硅胶柱上，从正己烷馏分中用正己烷-乙醇(100∶1)逐级洗脱，得到20子馏分。

将子馏分6(600m g)层析于S e p h a d e s L H-20柱上，得到粗生物碱馏分(200m g)。

通过逆向H P L C将化合物1(R t14.15分钟)分离。

化合物1用甲醇再结晶得到化合物1(100m g)。

化合物1的鉴定
淡黄色粉末
UV(CHCl3)λmax(logε)：388.10(3.88)，314.20(3.94)，287.20(4.45)， 276.50(4.42)，262.10(4.42)，235.50(4.56)nm
IR(KBr)νmax：3220，1701，1648，1427，1319，1257，1031，972，835， 737，604cm-1
EIMS(m/z)(rel.int.)：279[M+](100)，264(31)，236(25)，194(61) 1
H N M R(300M H z，D M S O-d6)：δ10.32(O H)，9.10(1H，d d，J＝
8.85，2.50Hz，H-5)，7.94(1H，dd，J＝8.16，2.25Hz，H-8)，7.62(1H，s， H-2)，7.58(2H，td，J＝7.00，7.25Hz，H-6 and H-7)，7.28(1H，s，H-9)， 4.01(3H，s，OCH3)，3.38(3H，s，NCH3)ppm
13
C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ166.79(C-1)，152.17(C-3)，148.81 (C-4)，136.93(C-9a)，134.64(C-4a)，129.01(C-8)，127.44(C-6)，126.86 (C-5)，126.30(C-8a)，125.57(C-7)，120.96(C-1a and 1b)，120.14(C-5a)， 113.60(C-2)，103.48(C-9)，59.52(O C H3)，26.17(N C H3)p p m
以上面的化学和分光光度结果为基础，鉴定化合物1为10-氨基甲基-4-甲氧基-3-羟基-菲-1-羧酸内酰胺，三白草内酰胺(C r o h a r e，R.，P r i e s t a p，H.A.，F a r i n a，M.，C e d o l a，M.a n d R u v e d a，E.A.(1962) A r i s t o l a c t a m s o f a r i s t o l o c h i a a r g e n l i n a.P h y t o c h e m i s t r y 13：1957-1960 Priestap，H.A.(1989)13C-NMR spectroscopy of
a r i s t o l o c h i c a c i d a n d a r i s t o l a c t a m s.M a g n.R e s o n.C h e m.27：460-465 a n d P r i e s t a p，H.A.(1985a)S e v e n a r i s t o l a c t a m s f r o m Aristolochia argentina.Phytochemstry 24：849-852)。

实施例3
化合物2的分离和鉴定
在分离化合物1的过程中，收集半制备H P L C(R t15.90分钟)的峰并以化合物1的相同方式获得化合物2(10mg)。

化合物2的鉴定
淡黄色粉末
UV(CHCl3)λmax(logε)：380.00(3.74)，314.20(3.78)，285.20(4.33)， 275.00(4.35)，261.20(4.27)，230.00(4.41)nm
IR(KBr)νmax：3220，1701，1648，1427，1319，1257，1031，972，835， 737，604cm-1
E I M S(m/z)(r e l.i n t.)：279[M+](100)，264(59)，236(66)
1
H N M R(300M H z，D M S O-d6)：δ10.85(N H)，9.12(1H，d d，J＝
8.32，2.01Hz，H-5)，7.94(1H，dd，J＝8.32，2.01Hz，H-8)，7.85(1H，d， J＝2.01Hz，H-3)，7.57(2H，m，H-6 and H-7)，7.14(1H，s，H-9)，4.10 (3H，s，OCH3)，4.01(3H，s，OCH3)ppm
13
C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ168.85(C-1)，154.71(C-3)，150.86 (C-4)，135.80(C-9a)，135.30(C-4a)，129.51(C-8)，127.95(C-6)，127.30 (C-5)，126.38(C-8a)，125.96(C-7)，123.78(C-1a)，122.60(C-1b)，120.75 (C-5a)，110.37(C-2)，105.07(C-9)，60.39(OCH3)，57.40(OCH3)ppm 以上面化学和分光光度结果为基础，鉴定化合物2为10-氨基-3，4-甲氧基-3-羟基-菲-1-羧酸内酰胺，土青木香内酰胺B I I(C r o h a r e，R.，
P r i e s t a p，H.A.，F a r i n a，M.，C e d o l a，M.a n d R u v e d a，E.A.(1962)
A r i s t o l a c t a m s o f A r i s t o l o c h i a a r g e n l i n a.P h y t o c h e m i s t r y 13：1957-1960 Priestap，H.A.(1989)13C-NMR spectroscopy of
a r i s t o l o c h i c a c i d a n d a r i s t o l a c t a m s.M a g n.R e s o n.C h e m.27：460-465 a n d P r i e s t a p，H.A.(1985a)S e v e n a r i s t o l a c t a m s f r o m Aristolochia argentina.Phytochemstry 24：849-852)。

实施例4
化合物3的合成和鉴定
通过酯化分离三白草内酰胺和E-对甲氧基肉桂酸合成化合物3。

将分离三白草内酰胺(10m g)和E-对甲氧基肉桂酸溶于无水甲苯并加入二环己基碳二亚胺和4-二甲基氨基吡啶。

并将它们在油浴中于70℃、A r气下搅拌。

反应18小时之后，将溶液过滤除去副产物脲。

将滤液于真空下蒸发并在硅胶柱上逐级从正己烷∶C H2C l2∶M e O H层析得到化合物3。

化合物3的鉴定
黄色粉末
EIMS(m/z)(rel.int.)：409(17)[M+]，293(16)，279(14)[M+-肉桂酸 ]，224(9)178(100)，164(72)，131(56)
1
H N M R(300M H z，C D C l3)：9.10(1H，d，J＝8.32H z，H-5)，8.00
(1H，d，J＝15.90Hz，H-7′)，7.92(1H，s，H-2)，7.87(1H，m，H-8)，7.69
-7.55(4H，m， H-2′，3′，5′，6′)，7.45(2H，m，H-6 and H-7)，7.10(1H， s，H-9)，6.75(1H，d，J＝15.90Hz，H-8′)，4.01(3H，s，OCH3)，3.50(3H， s，NCH3)ppm
通过物理和光谱数据鉴定化合物3为分离三白草内酰胺-3-O-E-对甲氧基肉桂酸酯
EIMS(m/z)(rel.int.)：409(17)[M+]，293(16)，279(14)[M+-肉桂酸 ]，224(9)178(100)，164(72)，131(56)
1
H N M R(300M H z，C D C l3)：9.10(1H，d，J＝8.32H z，H-5)，8.00
(1H，d，J＝15.90Hz，H-7′)，7.92(1H，s，H-2)，7.87(1H，m，H-8)，7.69 -7.55(4H，m，H-2′，3′，5′，6′)，7.45(2H，m，H-6 and H-7)，7.10(1H，
s，H-9)，6.75(1H，d，J＝15.90Hz，H-8′)，4.01(3H，s，OCH3)，3.50(3H，s，NCH3)ppm
试验实施例
试验方法
1.动物：将从汉城大学饲养站获得的S p r a g u e-D a w l e y大鼠在汉城大学药学院的饲养站饲养。

饲养站保持在22±5℃，光照时间为7A M至7P M，喂食含有粗蛋白23.2％、粗脂4.0％、粗纤维6.0％、粗灰分10.0％、粗钙0.6％和粗磷0.4％的固体饲料(Seoul，Samyangsa)。

2.皮层细胞培养物
含有神经元和神经胶质细胞的混合皮层细胞原代培养物是按照前面所述的大鼠胎儿制备的(Kim YC，Kim SR，Markelonis GJ and Oh TH(1998) Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration.J.Neurosci.Res.53：
426-432)。

将这些皮层细胞以1×106个细胞/m l的密度涂布到涂敷有胶原的平皿中。

将这些培养细胞在补充有10％热失活的胎牛血清、1m M丙酮酸钠、100I U/m l青霉素和100μg/m l链霉素的D M E M中于37℃和95％空气/5％C O2的湿化环境下生长。

在用于试验之前将培养物成熟2周。

3.给予三白草提取物
将三白草总提取物、馏分和分离物质溶于D M S O(在最终培养浓度内，0.1％)，用蒸馏水稀释，并使溶液通过微孔膜(0.22μM，Millex-Gv，USA)过滤使其无菌。

按不同浓度将该溶液来培养并分配给神经元细胞。

1)MTT测定
在培养过程中向皮层细胞的培养肉汤中加入10％培养肉汤的M T T(5m g/m l)。

将该肉汤培养3个多小时。

形成的甲被D M S O溶解并测定540n m下的吸收(M o s m a n n T(1983)R a p i d c o l o r i m e t r i c a s s a y f o r cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays.J.Immuno.Methods 65：55-61)。

2)一氧化氮的测定
从原化培养皮层细胞中分离到培养肉汤中的亚硝酸盐的含量是使用Griess试剂通过Dawson’s法测定的(Dawson VL，Brahbhatt HP，Mong JA and Dawson TM(1994)Expression of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary neuronal-glial cortical cultures.Neuropharmacology 33：1425-1430)。

3)细胞中Ca2+浓度的测定
通过计量待测定的样品来测定原化培养的皮层细胞中的C a2+浓度，并在1小时之后用谷氨酸盐诱导神经毒性，使用Fura-2AM测定
(Grynkiewicz G.Poenie M and Tsien RY(1985)A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties. J.Biol.Chem.260：3440-3450)。

4)结果和讨论
我们使用大鼠皮层细胞原代培养物作为体外试验体系以从防止谷氨酸盐诱导神经毒性的天然产品中分离神经保护性化合物(K i m等，1998)。

在我们的培养物中筛选具有抗谷氨酸盐诱导伤害的保护效果的天然源时，我们已发现来自三白草球(三白草属)的根的C H C l3/M e O H提取物具有显著的神经保护活性(表1)。

分离化合物1和2并在s e p a d e x L H-20上柱层析和半制备H P L C鉴定为下式的三白草内酰胺和土青木香内酰胺。

三白草内酰胺 土青木香内酰胺BII
三白草内酰胺-3-O-(E)-对-甲氧基肉桂酸酯
图1 化合物1-3的结构
生物试验介导三白草总提取物馏分证实正己烷馏分是最具活性的一种(10g/m l下50.6％抗谷氨酸盐诱导毒性的保护作用，p＜0.001)(表1)。

通过几个色谱法进一步馏分和分离正己烷馏分得到两个化合物1和2。

通过物理和光谱数据与公开的数据比较而鉴定化合物1和2为10-氨基甲基-4-甲氧基-3-羟基-菲-1-羧酸内酰胺(三白草内酰胺)和10-氨基-3，4-甲氧基-3-羟基-菲-1-羧酸内酰胺(土青木香内酰胺B I I)(C r o h a r e等，1962 P r i e s t a p等，1985a P r i e s t a p，1989)。

在我们的培养体系中进一步测定分离三白草内酰胺和土青木香内酰胺B I I的神经保护活性。

在有生物碱的情况下在D M E M中培养24小时之后，测定培养物的神经元的破坏程度(充分处理)。

在充分处理范例中分离三白草内酰胺和土青木香内酰胺B I I在1.0-10.0M的浓度范围显示显著的生物保护活性(表2)。

最初在兴奋毒性刺激之前或之后通过定时暴露于生物碱评价这两种抗谷氨酸盐诱导毒性的土青木香内酰胺生物碱的神经保护活性。

将一部分培养物用生物碱预处理1小时，之后简单暴露于谷氨酸盐(30分钟)，洗涤并在D M E M中在没有生物碱的情况下保持24小时(预处理)(表3)。

同样，将培养物首先在谷氨酸盐中暴露30分钟，洗涤并在有生物碱的情况下在DMEM中保持24小时(后处理)(表4)。

正如表4所显示的，这些生物碱以0.1-10.0M的浓度显著地抑制后处理中谷氨酸盐诱导的神经毒性。

然而，在预处理范例中分离三白草内酰胺和土青木香内酰胺B I I未显著地保护培养的皮层细胞防止谷氨酸盐诱导的神经毒性(表3)。

由这些结果，土青木香生物碱不能直接拮抗谷氨酸能(g l u t a m a t e r g i c)受体结合或早期谷氨酸能受体介导的细胞反应。

暗
示这些生物碱在谷氨酸能受体过度激活之后在下游可以起细胞反应的作
用。

这还被我们的结果所证实，该结果显示土青木香内酰胺生物碱在谷氨酸盐诱导的神经毒性早期细胞内C a2+增加没有任何显著影响(数据未显示)。

过量的细胞内神经元C a2+浓度可以激活一系列酶，包括一氧化氮合成酶(N O S)、蛋白激酶C、磷脂酶和蛋白酶。

当N O S被激活时，产生过量N O，已知N O涉及谷氨酸盐的神经毒性(M a s a n o r i等，1998)。

N O与超氧化物阴离子反应形成过氧亚硝酸盐自由基，这样导致产生剂量依赖性神经元破坏(A l m e i d a等，1998)。

因此，我们评价土青木香内酰胺B I I(更有潜能的神经保护性生物碱)对培养物中N O含量的影响(表5)。

仅用谷氨酸盐处理的皮层培养物显示形成的N O增加，而用谷氨酸盐和土青木香内酰胺B I I处理过的培养物中的N O含量仅略微增加(表5)。

该结果暗示土青木香内酰胺B I I可抑制过氧亚硝酸根过度生产或者N O S过度激活。

谷氨酸盐受体激活还刺激磷脂酶A2(L i p t o n a n d R o s e n b e r g，1994)。

磷脂酶A2的激活导致产生其代谢物花生四烯酸。

花生四烯酸加强N M D A 激发的电流并抑制谷氨酸盐重摄取到星形胶质细胞和神经元中，从而进一步加剧该病症(M i l l e r等，1992)。

在花生四烯酸代谢过程中可以形成氧自由基，进一步导致磷脂酶A2激活(L a f o n-C a z a l等，1993)。

谷氨酸盐诱导神经元变性的另一公知机理是氧化应力(C h o i，1988 C o y l e a n d P u t t f a r c k e n，1993)。

C N S神经元不容量受氧化应力的破坏，这是由于其氧消耗速度高并且其神经系统的细胞中多不饱和脂肪酸含量高
(B u c k m a n n等，1993)。

虽然如此，大脑是包括高含量的几种抗氧化剂化合物(例如G S H)和几种抗氧化剂酶(例如过氧化氢酶、S O D、G S H-p x和G S S G-R)的细胞防御体系。

因此，我们测定了土青木香内酰胺B I I对抗氧化剂酶活性的影响。

然而，该生物碱未显示对过氧化氢酶、S O D和G S H-p x 活性的显著保护效果(数据未显示)。

因此，土青木香内酰胺B I I能够通过直接作用于N O S上而保护培养的脑神经元防止谷氨酸盐诱导的神经元毒性。

然而，进一步进行试验以证实该假定机理。

另一方面，我们以前已获得(E)-对甲氧基肉桂酸作为神经保护剂的专利。

因此，我们改变土青木香内酰胺生物碱的化学结构，以便改进土青木香内酰胺生物碱的可信的神经保护活性。

我们通过化学地改变分离三白草内酰胺和E-p-M C A来合成分离三白草内酰胺-3-O-(E)-对甲氧基肉桂酸酯(S-M C A)。

使用我们的体外培养体系来评价S-M C A的神经保护活性
(表6和7)。

在预处理和后处理范例中S-M C A都显示对谷氨酸诱导的神经毒性有显著的神经保护活性。

即，与仅在后处理范例中显示显著保护活性的土青木香内酰胺生物碱和仅在预处理范例中显示显著保护活性的E-p-M C A相比，S-M C A具有提高的神经保护活性。

因此，S-M C A是治疗和预防神经变性疾病的非常合适的候选物。

S-M C A的提高的神经保护活性通过我们的连续试验研究进一步得到证实。

S-M C A能够成功地阻断过量谷氨酸盐诱导的细胞内C a2+增加(表8)。

而且，S-M C A能够显著地阻断N O合成，结果在预处理和后处理范例中都成功地阻断了细胞内C a2+增加(表9)。

S-M C A还降低了谷氨酸盐损伤的皮层神经元中细胞过氧化物水平。

5)通过谷氨酸盐诱导神经毒性
将直接从大鼠胎儿分离的皮层细胞培养14天。

待测样品以不同浓度处理培养细胞。

1小时之后，通过处理100μM谷氨酸盐诱导神经毒性。

24小时之后，通过M T T试验测定存活细胞的比例以确定样品的神经保护活性。

6)统计分析
对每个试验组用数量3(n＝3)进行统计显著性研究。

使用方差分析(A N O V A试验)评价数据的统计显著性。

以5％的概率值设定统计显著性的置信度。

一部分对细胞存活力的神经保护性影响a。

a充分处理：预处理和仅回收(recovery)的组合处理。

b谷氨酸盐处理的与对照显著不同，P＜0.001。

对照是大鼠皮层细胞的原代培养物的值。

M T T 的对照值是1.03±0.08光密度(O D )。

谷氨酸盐处理的是在谷氨酸盐中暴露30分钟的大鼠皮层细胞的原代培养物的值。

M T T 的谷氨酸盐处理过的值是0.58±0.02 O D 。

存活力是以下式计算的：100×(处理过的样品的O D -谷氨酸盐处理过浓度(μM)
存活力(％)对照
100.0±4.2谷氨酸盐处理过的b
0.0±1.3总提取物1
8.0±0.510
24.1±1.2*100
45.1±1.5**CH 2Cl 2馏分1
1.0±3.010
27.6±3.6*100
52.6±2.9**正己烷馏分1
60.4±1.8***10
50.6±0.7**100
34.3±2.0*90％甲醇馏分1
7.5±0.810
14.6±1.7100
0.9±2.2水馏分1
没有影响10
没有影响100
没有影响正丁醇馏分1
没有影响10
没有影响100没有影响
胺或土青木香内酰胺BII对细胞存活力的影响a。

浓度(μM)存活力(％)
对照100.0±4.2
谷氨酸盐处理过的b0.0±1.3
分离三白草内酰胺0.1没有影响
1.039.0±1.8*
10.046.6±2.1**
土青木香内酰胺BII0.1没有影响
1.060.8±
2.1***
10.052.2±3.2**
a表2的试验方案、名称和脚注与表1中所述的完全相同。

表3.在谷氨酸盐破坏的大鼠皮层细胞中预处理时分离三白草内酰胺或土青木香内酰胺BII对细胞存活力的神经保护性影响a。

浓度(μM)存活力(％)
对照100.0±4.2
谷氨酸盐处理过的b0.0±1.3
分离三白草内酰胺0.10.0±4.5
1.00.0±
2.1
10.0毒性影响
土青木香内酰胺BII0.10.0±7.8
1.00.0±3.2
10.032.2±0.8*
a预处理：在谷氨酸盐破坏之前对样品进行1小时处理。

b谷氨酸盐处理过的与对照显著不同，p＜0.001。

表3的名称和脚注与表1中所述的完全相同。

或土青木香内酰胺BII对细胞存活力的神经保护性影响a。

浓度(μM)存活力(％)
对照100.0±4.2
谷氨酸盐处理过的b0.0±1.3
分离三白草内酰胺0.10.0±2.9
1.066.3±
2.1**
10.032.1±1.9*
土青木香内酰胺BII0.158.5±5.8**
1.068.4±3.5***
10.047.8±2.9**
a后处理：在30分钟谷氨酸盐破坏之后立即对样品进行处理。

b谷氨酸盐处理过的与对照显著不同，p＜0.001。

表4的名称和脚注与表1中所述的完全相同。

表5.在后处理时土青木香内酰胺B I I对从谷氨酸盐破坏的大鼠皮层细胞中释放的NO含量的影响a。

浓度(μM)亚硝酸盐(nM)
对照75.5±2.7
谷氨酸盐处理过的b145.7±5.2
土青木香内酰胺BII0.187.0±0.8**
1.086.8±
2.2**
10.0103.2±1.2*
N-硝基-L精氨酸c0.1103.9±3.5*
10.088.5±4.1**
100.0109.7±1.9*
a表5的试验方案、名称和脚注与表4中所述的完全相同。

b谷氨酸盐处理过的与对照显著不同，p＜0.01。

c N-硝基-L-精氨酸：一氧化氮合成酶抑制剂
-3-O -(E )-对甲氧基肉桂酸酯对细胞存活力的神经保护性影响a。

a预处理：在谷氨酸盐破坏之前对样品进行1小时处理。

b谷氨酸盐处理过的与对照显著不同，p＜0.001。

表6的名称和脚注与表1中所述的完全相同。

表7.在谷氨酸盐破坏的大鼠皮层细胞中后处理时分离三白草内酰胺-3-O -(E )-对甲氧基肉桂酸酯对细胞存活力的神经保护性影响a。

a 后处理：在30分钟谷氨酸盐破坏之后立即对样品进行处理。

b谷氨酸盐处理过的与对照显著不同，p＜0.001。

表7的名称和脚注与表1中所述的完全相同。

表8.在谷氨酸盐破坏的大鼠皮层细胞中预处理时分离三白草内酰胺-3-O-(E)-对甲氧基肉桂酸酯对[Ca 2+
]i的影响a。

浓度(μM)
存活力(％)对照
100.0±4.2谷氨酸盐处理过的b
0.0±1.3分离三白草内酰胺
-3-O-(E)-对甲氧基肉桂酸酯
0.129.8±8.2*1.067.2±9.6***10.0
80.6±9.5***
浓度(μM)
存活力(％)对照
100.0±4.2谷氨酸盐处理过的b 0.0±1.3分离三白草内酰胺-3-O-(E)-对甲氧基肉桂酸酯
0.162.1±1.8***1.0
70.3±3.2***
10.048.2±1.5**浓度(μM)
[Ca 2+]i(nM)对照
75.5±15.0谷氨酸盐处理过的b
425.4±20.0分离三白草内酰胺
-3-O-(E)-对甲氧基肉桂0.1233.3±14.9***1.0
145.8±26.3***。