乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备以及对有机磷的检测应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910403325.7
(22)申请日 2019.05.15
(71)申请人 贵州大学
地址 550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大
学花溪北校区科技处
(72)发明人 李升　曲立梅　
(74)专利代理机构 贵阳中新专利商标事务所
52100
代理人 刘艳
(51)Int.Cl.
G01N 27/30(2006.01)
G01N 27/327(2006.01)
G01N 27/48(2006.01)
(54)发明名称
乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备以及对有
机磷的检测应用
(57)摘要
本发明通过合成铜纳米线。

将铜纳米线与
rGO -TEPA进行混合，修饰到玻碳电极上，室温干
燥之后，再将乙酰胆碱酯酶与壳聚糖戊二醛混合
物修饰到电极上，放在冰箱孵育直至其干燥，构
建乙酰胆碱酯酶-壳聚糖-戊二醛/还原性氧化石
墨烯-四乙烯五胺-铜纳米线/玻碳电极(AChE -
CS/rGO -TEPA -Cu NWs/GCE)生物传感器。

本发明
利用有机磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用构建了
一种用于有机磷检测的电化学生物传感器。

简单
方便并且具有灵敏度高等优点，为有机磷的检测
技术开拓了新的空间。

权利要求书1页 说明书3页 附图5页CN 110031521 A 2019.07.19
C N 110031521
A
1.一种乙酰胆碱酯酶生物传感器，其特征在于：所述的生物传感器是在玻碳电极表面依次负载铜纳米线-rGO -TEPA和乙酰胆碱酯酶-壳聚糖-戊二醛混合物。

2.如权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)化学还原合成法制备铜纳米线；
(2)将步骤(1)中所制得的铜纳米线与rGO -TEPA进行物理混合并超声处理得到均匀的混合液；
(3)将步骤(2)中所制得的铜纳米线与rGO -TEPA的混合液滴加于玻碳电极表面，外面修饰乙酰胆碱酯酶混合液，置于4℃冰箱中孵育至电极干燥，即得到AChE -CS/rGO -TEPA -Cu NWs/GCE乙酰胆碱酯酶生物传感器。

3.根据权利2要求所制备的方法，其特征在于：步骤(2)中rGO -TEPA与铜纳米线混合比例为2:1。

4.根据权利2要求所制备的方法，其特征在于：步骤(2)乙酰胆碱酯酶混合液中包含乙酰胆碱酯酶、壳聚糖和戊二醛。

5.根据权利要求4所述的制备的方法，其特征在于：所述的乙酰胆碱酯酶与壳聚糖、戊二醛的混合液比例为1:1:1。

6.一种由权利要求1或2一种乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷的方法，其特征在于：所述的生物传感器为AChE -CS/rGO -TEPA -Cu NWs/GCE，所述方法包括将AChE -CS/rGO -TEPA -Cu NWs/GCE电极浸入到不同浓度有机磷农药10分钟，然后转移到2mMATCl溶液中进行差分脉冲伏安法检测，记录下电极的i P ,有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率可按照如下公式表达：
Inhibition(％)＝(I 0-I i )/I 0×100％
其中I 0表示传感器在原始ATCl溶液中检测的电流响应，I i 表示传感器在有机磷溶液中抑制10分钟后在相同浓度下ATCl溶液中检测的电流响应。

7.根据权利要求6所述的一种乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷的方法，其特征在于：该传感器实现了对有机磷浓度的检测范围为0.01ng/mL～100ng/mL。

其有效检出限为0.01ng/mL。

权　利　要　求　书1/1页CN 110031521 A
乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备以及对有机磷的检测应用
技术领域
[0001]本发明属于有机磷农药领域领域，涉及到生物传感器，具体涉及到一种乙酰胆碱酯酶有机磷农药生物传感器及其制备方法。

背景技术
[0002]我国是一个农业大国，有机磷农药的广泛应用在预防农作物病虫害方面起了巨大作用，但是随着有机磷农药的长期滥用，它已经成为了危害环境安全和人类健康的重大安全隐患。

因此建立一套安全、灵敏的有机磷检测方法显得尤为重要。

[0003]传统的有机磷检测方法有：气相色谱法、液相色谱法、酶联免疫分析法以及质谱法等。

但是这些方法设备价格昂贵，测定时间较长，不适合现场检测。

而生物传感法检测有机磷因其操作简单，灵敏度高，引起广泛关注。

发明内容
[0004]针对现存检测有机磷方法的不足，本发明的目的在于，提供一种了一种操作简单，成本低廉，灵敏度高，能实现快速检测有机磷农药的AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE生物传感器及其制备方法。

[0005]具体地，本发明的检测有机磷的电化学传感器是以玻碳电极为基底电极，将rGO-TEPA-Cu NWs混合材料(2:1)修饰到电极表面，待其在烤灯下干燥之后，再在其表面覆盖一层戊二醛-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶混合膜，置于4℃冰箱干燥，构建了用于检测农药残留的电化学生物传感器。

其中rGO-TEPA具有片状的褶皱，增加电极的比表面积，铜金属元素，可以催化硫代胆碱的氧化，rGO-TEPA-Cu NWs混合材料的协同作用可以增加材料的稳定性，同时避免铜纳米线的氧化。

[0006]本发明以上所述的铜纳米线通过化学还原法合成，将1mL0.1M硝酸铜，0.16mL EDA 和25μLN2H4(55wt％)溶液依次加入到20mL高度浓缩的氢氧化钠(15M)溶液中，在60℃条件下反应两个小时。

在溶液的表面得到了一层糕红状的物质，即为终产物铜纳米线。

[0007]根据本发明的实施方案，提供了使用AChE生物传感器检测有机磷，比如马拉硫磷的方法，所述的方法包括将构建的AChE生物传感器浸入到不同浓度有机磷溶液孵育10分钟，采用差分脉冲伏安法，进行电化学检测，建立不同浓度的马拉硫磷与乙酰胆碱酯酶抑制率的标准曲线。

[0008]本发明的有益效果：还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺(rGO-TEPA)具有优异的导电性，可以增强电流响应，多层褶皱的片层结构可以增加电极的比表面积，同时增加乙酰胆碱酯酶的负载量。

铜作为一种金属，价格便宜的同时可以增加硫代胆碱的氧化能力，纳米线的高比表面积可以增加电极稳定性。

壳聚糖是天然产物，且具有良好的生物相容性和稳定性，能够在电极表面很好的保持乙酰胆碱酯酶的活性。

因此，在本发明中构建乙酰胆碱酯酶/ rGO-TEPA-铜纳米线/玻碳电极，用来检测有机磷。

[0009]由上可知，本发明操作简单，快速方便，解决了传统检测有机磷耗费时间长，操作
繁琐等问题。

附图说明
[0010]图1是本发明制备的AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE生物传感器的实验流程图；[0011]图2是AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE生物传感器的电化学行为，(a)rGO-TEPA-Cu NWs/GCE在ATCl溶液中的循环伏安图；(b)AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE在PBS溶液中的循环伏安图；(c)AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE在ATCl溶液中的循环伏安图；
[0012]图3是AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE在铁氰化钾体系中的阻抗图(A)和伏安图(B)；
[0013]图4是(A)AChE传感器经过不同浓度的马拉硫磷：(a)0；(b)0.01ng/mL；(c)0.1ng/ mL；(d)1ng/mL；(e)10ng/mL；(f)30ng/mL；(g)60ng/mL；(h)100ng/mL孵育之后在含有2mM ATCl的PBS溶液中的DPV响应图；图4(B)马拉硫磷的浓度与酶活性抑制率的线性关系图。

具体实施方式
[0014]为让本发明的技术方案和优点更易于被本领域的的技术人员理解，下面结合附图说明对本案例具体实施方式进行较为详细的阐述。

显然，所描述的实施案例仅仅是本发明一部分实施案例而不是全部的实施案例，基于本发明的实施，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

[0015]本发明检测有机磷的电化学传感器是以玻碳电极为工作电极，氯化银参比电极，铂丝电极为对电极。

[0016]2实验方法
[0017] 2.1化学还原法制备铜纳米线，具体步骤如下：
[0018](1)铜纳米线制备方法：将1mL0.1M硝酸铜，0.16mLEDA和25μLN2H4(55wt％)溶液依次加入到20mL高度浓缩的氢氧化钠(15M)溶液中，在60℃条件下反应两个小时，得到红色的终产物铜纳米线；
[0019](2)铜纳米线的干燥：将合成的铜纳米线经过无水乙醇和超纯水交替清洗离心之后置于60℃真空干燥箱中干燥过夜；
[0020](3)铜纳米线的分散：取2mg干燥的铜纳米线分散于1mL无水乙醇中，经过两个小时的超声分散得到均匀的铜纳米线分散液，常温下储存备用。

[0021] 2.2rGO-TEPA-Cu NWs混合液的制备
[0022]称取2mg rGO-TEPA分散于超纯水中，超声5个小时得到分散均匀的分散液。

[0023]将rGO-TEPA分散液与Cu NWs分散液按照2:1进行物理混合并超声两个小时使其分散混合均匀。

[0024] 2.3修饰电极的制备
[0025](1)将玻碳电极分别在0.1μm和0.05μm的抛光粉上进行打磨，并依次用超纯水，无水乙醇，丙酮，超纯水进行超声洗涤，最后置于白炽灯下烤干；
[0026](2)修饰电极的准备，在处理好的电极表面滴加6μLrGO-TEPA-Cu NWs混合液，干燥之后，再在表面滴加戊二醛-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶混合液，置于4℃冰箱中孵育。

[0027] 2.4检测过程
[0028]将制备好的电极分别浸入到不同浓度的马拉硫磷溶液中孵育10分钟，然后转移到2mMATCl溶液中进行差分脉冲伏安法检测，记录下电极的i P,有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率可按照如下公式表达：
[0029]Inhibition(％)＝(I0-I i)/I0×100％
[0030]其中I0表示传感器在原始ATCl溶液中检测的电流响应，I i表示传感器在有机磷溶液中抑制10分钟后在相同浓度下ATCl溶液中检测的电流响应。

[0031]3结果与讨论：
[0032] 3.1传感器的电化学行为：
[0033]图2为三种电化学传感器的循环伏安曲线。

其中，rGO-TEPA-CuNWs/GCE(曲线a)在ATCl底物溶液中没有明显氧化还原峰出现，AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE(曲线b)在0.1MPBS(Ph＝7.4)溶液中同样没有明显氧化还原峰出现，但是当在PBS溶液中添加底物ATCl底物溶液，AChE-CS/rGO-TEPA-Cu NWs/GCE(曲线c)出现明显的氧化还原峰，说明电流的产生是在乙酰胆碱酯酶的催化作用下，水解ATCl底物溶液产生硫代胆碱的氧化而形成的。

[0034] 3.2传感器的电极构建过程。

[0035]图3(A)是表明了用循环伏安法(cv)法证明了电极的构建过程。

在铁氰化钾体系中，裸电极(曲线c)呈现一对明显的氧化还原峰。

随着电极表面材料的修饰，由于材料优异的导电性，rGO-TEPA-CuNWs/GCE(曲线b)呈现的氧化还原峰值增大。

固定乙酰胆碱酯酶之后，由于酶是大分子蛋白质不导电阻碍了界面的电子传递，因此峰电流变小，这也直接证明了酶已经成功固定到电极表面。

[0036]图3(B)是表明了用阻抗(EIS)法证明了电极的构建过程。

Niquist图是一种最常用的阻抗表现形式。

在修饰材料之后，与裸电极(曲线a)相比，曲线b的阻抗明显降低，表面了材料优异的导电性，当固定乙酰胆碱酯酶后，阻抗明显增大(曲线c)，证明了乙酰胆碱酯酶的成功固定。

[0037] 3.3不同浓度马拉硫磷的检测
[0038]将修饰好的玻碳电极分别浸入到不同浓度的马拉硫磷溶液中孵育10分钟，然后将电极转移到2mMATCl溶液中检测，采用差分脉冲伏安法。

[0039]图4为马拉硫磷浓度梯度与乙酰胆碱酯酶抑制率标准曲线图。

此曲线表明,随着马拉硫磷标准溶液浓度的增加,对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率逐渐上升,马拉硫磷对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率的线性范围为0.01ng/ml-100ng/ml,有效检出限为0.01ng/mL。

图1
图2
图3
图4。