菌种制备工艺流程图

菌种制备工艺
菌种的分离纯化
1、初筛
以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。

将原菌种制备成菌悬液或单孢子悬液，梯度稀释，涂布分离平板，28±0.5℃培养6-8天，成熟后挑单菌落传F1斜面，F1斜面成熟后传F2斜面，同时转接种子瓶、发酵瓶进行初筛。

F2斜面成熟后转接种子瓶、发酵瓶进行复筛。

具体的工艺过程如下：
⑴、菌悬液或单孢子悬液制备——将菌种震荡均匀或使用玻璃珠打散，梯度稀释至合适的浓度，该浓度要保证涂布平板后能够分离出单菌落，通常稀释至10-7。

菌种的来源通常有：高单位罐批的发酵液、保存的用于生产的冻存管菌种等。

⑵、分离平板的涂布与培养——将梯度稀释的菌悬涂布到分离平板上培养，培养温度：28±0.5℃，相对湿度40%—45%，通常培养6～8天即可生长出合适的单菌落，培养时第一天正置平板，第二天起倒置培养。

⑶、F1斜面的培养——在分离平板上选取合格的单菌落接种到F1斜面上，合格单菌落的特点为：菌落直径4～6mm、圆形、边缘不光滑、中间有白色小突起，不规则皱褶、扁平、产生孢子。

F1斜面的培养温度：28±0.5℃，湿度40%—60%，通常培养6—8天即成熟。

成熟的斜面特征为菌苔微厚而丰满，分布有白色孢子，表面呈鼠灰色，背面呈黑色。

⑷、F2斜面的培养——选取生长良好、无杂菌的成熟F1斜面，使用接种针转接到F2斜面，F2斜面的培养温度：28±0.5℃，湿度40%—60%，通常培养6—8天即成熟。

⑸、初筛—— F2斜面接种的同时，使用接种铲刮取约0.5—1cm2的菌苔至种子瓶，种子瓶在28℃的摇床上培养22—24h，然后按照8%—10%的接种量移种至发酵瓶中，发酵瓶在28℃的摇床上培养（240rpm）至200h放瓶，依据发酵瓶的放瓶效价初选出合适的F1斜面，通常选取发酵单位高于3500u/ml的F1斜面。

2、复筛
复筛是精选，以质为主，也就是以精确度为主。

经过初筛选取出合适的F1斜面后，选取该F1斜面传代的F2斜面，进行复筛。

刮取成熟的F2斜面菌苔0.5—1cm2接种到种子瓶，种子瓶在28℃的摇床上培养22—24h，然后按照8%—10%的接种量移种至发酵瓶中，发酵瓶在28℃的摇床上培养(240rpm)至200h放瓶，依据发酵瓶的放瓶效价再次验证初筛选取的高单位F1斜面，通常复筛发酵酵单位应高于4000u/ml。

3、冻存管菌种的制备
由F1接种子瓶进行初筛的同时，种子瓶成熟后一部分转接发酵瓶进行初筛，另一部分分装至冻存管，制备冻存管菌种。

采用2ml冻存管，其中菌种保护液1ml，分装种子液1ml。

分装后先放至普通冰箱冷冻层（-20℃）进行预冻1—2h,然后直接放至液氮中进行保存。

冻存管的保存时间通常为1年。

菌种保护液的制备
甘油：40%
分离纯化工艺简图
取冻存管（或其他来源的菌种培养物）
↓ 玻璃珠打散，梯度稀释至10-6
10-3-10-6菌悬液接种分离平板，每皿0.2ml，28℃培养6-8天
↓
典型单菌落接斜面，28℃培养6-8天
↓
刮取0.5×0.5cm2的单菌落接种子瓶，转接发酵瓶，28℃培养6-8天
↓ 选取高于4000u/ml的菌种
生产菌种，优良种子制备冻存管，液氮保存
4、生产菌种的制备
依据生产的需要可以采取斜面孢子菌种上罐和种子瓶菌种上罐两种方式。

采用斜面孢子菌种上罐时，将适量无菌水倒在成熟的F2斜面上，用接种针刮下所有的孢子菌苔（包括基内菌丝），然后再倒入抽滤瓶中即可。

采用种子瓶菌种上罐时，刮取约0.5～1cm2的成熟F2斜面菌苔，接种到4个一级种子瓶中（0.5～1cm2 →50ml），置于摇床中培养，摇床转速240rpm，28±0.5℃培养22-24h即可。