实验一——鸡胚成纤维细胞的培养

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实验九：鸡胚成纤维细胞的制备

的主要因素，并掌握原代细胞培养的方
法。
四、实验步骤
（一）操作前的准备
1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净工作台； 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯.
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科
镊、平皿、吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；Hanks液，
0.25%胰酶消化液，双抗（10000IU/ml青链霉素）， 7.5%NaHCO3溶液，DMEM营养液，75%酒精棉。
三、实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重
内不易下沉，此时可中止消化。如再继续消化，可破
坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
（2）分散细胞将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加5mL含血清的DMEM生长液（DMEM营养液 +5%犊牛血清+100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3 溶液调pH7.2），以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。（3）过滤
（3）胚体匀浆
用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入Hanks液（淹住组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬

鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作

及细胞培养

（一）CEF的制备

1. 实验试剂

1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料

酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）

将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤

（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射

30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；

（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取

出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一

个培养皿中冲洗干净；

（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；

（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；

（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；

（7）重复第六步；

（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存

（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞培养

1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、

75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新

洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。

4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。

5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先

置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。

7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的

胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。

8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器

消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。

9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织

已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。

使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。

细胞工程实验总结

实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备

1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。

①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。

②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。

理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。

2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？

1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。

2）干粉培养基过滤除菌

（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）

认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。

配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签，4℃保存备用。

鸡胚成纤维细胞的制备

一、材料和试剂

1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚

2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠

3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等

二、操作步骤

1、操作前的准备：

○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。

○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

2、成纤维细胞制备：

①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。

②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。

③再用PH7.2的PBS冲洗两次。

④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。

⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。

⑥期间配制细胞培养液：

培养基：MEM

双抗：2%

7.5% 碳酸氢钠：2%

牛血清：6%

3% 谷氨酰胺：1%

⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。

成纤维细胞的培养

1前言

成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。

2材料和方法

2.1材料

玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管

塑料器材：细胞培养板

橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管

滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜

2.2试剂的配制

水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、

实验九：鸡胚成纤维细胞的制备

0.25mL至培养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细
胞悬液)，吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日
期，置37℃温箱中培养(4h后细胞即可贴壁，24-
36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种
病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免影响细胞的贴壁和生长。本实验培养3天，培养期间可每天观察1次。3天后取出，洗净培养瓶，放回实验室。
本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞的制备方法和影响细胞培养
的主要因素，并掌握原代细胞培养的方
法。
四、实验步骤
（一）操作前的准备
1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净工作台； 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯.
4、一般2d换一次培养液，细胞长成单层后要及时进行细胞传代
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗
涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
实验九鸡胚成纤维细胞的制备
一、实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法；了解原代细胞培养的原理和方法。
二、试验器具、试剂、仪器

CEF、DEF培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养

一、材料

9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,

血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。

二方法（CEF为例）

鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。

2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。

鸡胚成纤维细胞制备优秀课件

取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。（2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。
实验步骤
（四）细胞形态观察检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后，可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
实验步骤
（三）分装与培养 1、细胞计数
用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个/ml。

原代培养(13)

TCID50
（50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的
传统表示法，即能在细胞培养孔或试管内引起50%组织细胞
病变所需的病毒最高稀释度。
实验六干扰素（IFN）效价滴定
干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高稀释度仍能
保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害，则该稀释度的倒
数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升。
实验结果：
一、结果观察：镜下及染色观察，一般病毒对照孔出现3＋或 4＋，干扰素保护孔CPE不再进展时，可终止反应，并染色。
二、效价计算：
实验七中和试验 —稀释血清固定病毒法
实验结果：用倒置显微镜及活细胞染色观察。首先观察对照：
V对照（3+～4+）；S对照（-/±）；C对照（-）。以病变作为
二、讨论

自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精擦试，试剂等瓶口也要擦试。点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，
实验小结
实验一配液
实验二
原代鸡胚成纤维细胞的制备、培养及观察
一、实验结果观察

鸡胚成纤维细胞制备

取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。

将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。

最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。

抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。

经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。

体液免疫：

吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。抗体处理抗原——（效应阶段）

有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的

细胞免疫：

T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。

成纤维细胞的培养

1前言

2材料和方法

2.1材料

玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管

塑料器材：细胞培养板

橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管

滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜

2.2试剂的配制

细胞培养与病毒培养实验步骤

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的

了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。

二、常用细胞的种类

BHK-21：仓鼠肾传代细胞

PK-15：猪肾传代细胞

IBRS-2：猪肾传代细胞

Hela：人的子宫瘤细胞

Vero：非洲绿猴肾细胞

Marc-145：来源于Vero细胞

TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞

Sf9：昆虫细胞

三、材料

1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头

2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞

3、0.25%胰酶

4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

5、伪狂犬病病毒液（PRV）

四、传代细胞培养的条件要求

1）细胞密度：2-3×105个/ml

2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3）培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

五、常用细胞分散剂与作用原理

1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水

解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。

六、营养液

1、人工综合营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。

2、血清

1）血清的种类

鸡胚成纤维细胞的原代培养

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生拔钱诗晨

一、背景知识

1.1原代培养与传代培养

1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。

1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养

注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数

1.2细胞体外培养要求的条件

✓无菌

✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右

✓生理渗透压

✓适宜酸碱度：7.2-7.4

✓气体：95%空气+5%二氧化碳

✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型

悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。而呈现悬浮生长的细胞。

贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。又称黏附依赖型细胞（分如下四类）

✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射

状。

✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。

✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规

则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。

✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多

边形，胞突呈细长丝状。如神经元和神经胶质细胞

1.4原代细胞培养的一般办法

1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法

鸡胚原代细胞培养

细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。

组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。

很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。

组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。

本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。

（一）实验目的

了解单层细胞培养方法

（二）实验材料

1、10日龄鸡胚。

2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。

3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。

（三）实验方法

实验二_原代细胞培养

2. 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3. 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用无血清的DMEM冲冼2次。
4. 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5. 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗液。如此重复1次。
10.轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至 10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
11.细胞计数方法取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸
（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青霉素、 200μg/ml链霉素的DMEM
三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度原代细胞：4-6×105个/ml 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.67.8 3）培养温度
四、操作步骤
1. 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
实验二原代细胞培养
（以鸡胚成纤维细Biblioteka Baidu为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形
态，掌握鸡胚成纤维细胞