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采用柱切换色谱2离子阱质谱联用法研究复方丹参滴丸中丹参素及其代谢产物裴渭静1　赵新锋2　胡　震1　赵文明1　郑晓晖321(西安交通大学生命科学与技术学院,西安710049)2(西安交通大学中草药现代化研究及工程中心,西安710061)摘　要　采用柱切换高效液相色谱技术对人血清中的丹参素及其代谢产物进行富集和分离,利用对电喷雾离子阱多级质谱负离子模式进行结构分析。

一级流动相为甲醇2水(30∶70,V /V ),流速0.8mL /m in;二级流动相为甲醇2水2甲酸铵(15∶85∶0.5,V /V /V ),流速0.2mL /m in;在人血清中检测到丹参素及其代谢产物,并探讨了主要代谢产物乙酰化的丹参素(m /z 240.2)。

建立一种复方丹参滴丸中丹参素及其代谢产物在人体内代谢过程的高效分析方法。

该方法可用于复方丹参滴丸中丹参素及与其结构类似的其它药物的体内代谢研究。

关键词　复方丹参滴丸,丹参素,柱切换高效液相色谱技术,离子阱质谱　2004201212收稿;2004206226接受1　引 言复方丹参滴丸是根据复方丹参片[1]的处方,提取有效成分研制而成的中药滴丸剂。

主要成分为丹参(S alvia m iltorrhiza )、三七、冰片,临床用于治疗胸中憋闷,心绞痛,作为片剂的换代品,疗效高,作用迅速,副作用小,已被定为医院急诊必备中成药[2]。

丹参素为复方丹参滴丸的主要药效成分,对其分析和检测已有文献报道[3]。

柱切换高效液相色谱技术集样品净化、富集及分离为一体,样品前处理简单甚至不需要预处理就可直接进色谱分析,基本克服了以往样品前处理复杂、繁琐且耗费试剂、人工等缺点,该技术适合于分析含量低、干扰大、检测困难的复杂样品[4,5]。

液相色谱2多级质谱联用技术(LC 2MS n )可给出结构信息[6,7],对代谢产物准确定性[8,9]。

高效液相与高灵敏度的质谱结合,可对复杂样品进行实时分析,即使在色谱难分离的情况下,通过多级质谱对目标化合物进行碎片扫描,也可发现并突出混和物中的目标化合物,显著提高信噪比。

对基质复杂的体液样品中的微量成分仍可达到很高的检测灵敏度[10,11]。

本实验采用柱切换高效液相色谱2电喷雾离子阱质谱(CS 2HP LC 2ESI 2MS n )联用技术,在人血清中检测到了丹参素及其代谢产物,对主要代谢产物进行了机理探讨。

2　实验部分2.1　仪器和试剂1100系列高效液相色谱仪(美国Agilent 公司,包括DAD 和VWD 检测器、自动进样器、柱温箱内自动六通切换阀);1100系列电喷雾2离子阱质谱(美国Agilent 公司);TG L 216G 高速离心机(上海安宁科学仪器公司);基因公司Maxi m a 超纯水机;Sart orius BP221S 型电子天平(美国Sart orius 公司);TG328B 型电光分析天平(上海天平仪器厂)。

丹参素化学对照品(天津天士力制药股份有限公司提供);复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司,批号:20030716),规格:25mg/粒;甲醇(美国Fisher 公司,色谱纯);其它试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水。

2.2　分析条件(1)色谱条件:一级柱:Agilent S B 2C 18柱(100mm ×2.1mm ,5μm );二级柱:Agilent S B 2C 18柱(150mm ×2.1mm ,5μm );一级流动相:甲醇2水(30∶70),流速:0.8mL /m in 。

(2)质谱条件:电喷雾离子源;负离子检测;喷雾电压3.5k V;毛细管电压-101V,毛细管温度180℃;干燥气流速7L /m in;干燥气温度325℃;雾化气压力35p si;雾化气温度325℃,相对碰撞能为第33卷2005年4月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Che m istry 第4期505～50860%;化合物稳定性40%;质量扫描范围50～400a mu;刮削器电压-40V 。

2.3　样品制备2.3.1　对照品溶液的制备　称取一定量的丹参素对照品,加二级流动相配成0.246g/L 对照品溶液。

2.3.2　血清供试品溶液的制备　健康志愿者5名,空腹舌下含服10粒复方丹参滴丸,2.0h 后,静脉取血1.0mL,离心10m in (12000r/m in ),取血清样品0.5mL,置1mL 具塞离心试管中,加0.3mol/L 的三氯乙酸0.1mL,离心10m in (12000r/m in ),精密量取上清液置于试管中,氮气吹干,残渣用15%甲醇溶解,转入1mL 量瓶中,加15%甲醇至刻度,摇匀,滤过,作为给药供试品溶液。

志愿者未服用复方丹参滴丸时,取空白血清0.5mL,按上述方法制备,即得空白血清供试品溶液。

在未服用复方丹参滴丸药品的空白血清0.5mL 中,加入0.5mL 药品供试品溶液,按上述方法制备,即得空白血清加药供试品溶液。

2.3.3　药品供试品溶液的制备　将复方丹参滴丸20粒,研成粉末,50℃干燥至恒重,精密称取250mg,加15%甲醇30mL,超声处理20m in,滤过,减压蒸干,残渣转溶至100mL 量瓶中,以15%的甲醇定容。

2.4　待测物的CS 2HPLC 2ES I 2M S n 分析方法分别取对照品溶液和供试品溶液,自动进样器进样10μL,5m in 切换,选择负离子模式检测,先用全扫描(full scan )MS (相对碰撞能为零)质谱方式获得待测物的准分子离子峰[M -H ]-,再提高相对碰撞能,利用ESI 2MS n离子阱技术对准分子离子峰及其碎片离子进行多级质谱分析。

3　结果及讨论3.1　丹参素对照品的ES I 质谱裂解行为解析根据获得丹参素对照品的总离子流图和一级全扫描质谱图,对准分子离子m /z 196.6(M -H )及　图1　碎片离子m /z 196.6的二级扫描质谱图Fig .1　The electr os p ray i onizati on tan 2de m mass s pectra (ESI 2MS 2)of frag mentm /z 196.6m /z 394.6,分别进行二级质谱分析,逐渐增加电场强度,发现在MS 2时,m /z 196.6的碎片离子中,m /z 117.5、m /z 152.3相对丰度较大(见图1)。

m /z 394.6的主要碎片离子为m /z 196.6。

说明在负离子模式下,丹参素较易结合为二聚物,但提高电场能量后,二聚体几乎不存在,说明其不稳定性,或者是由于基质(溶剂)、电场等不稳定因素造成丹参素的二聚物的生成。

m /z 358.5是丹参素二聚物脱去2分子水后的碎片,虽然其离子强度远低于二聚体,但在一级和二级质谱中其离子强度保持稳定,说明二聚物脱水裂解反应是一个平衡反应,但对外界电场条件不敏感。

同时亦说明脱水的二聚物较二聚物本身更稳定,其离子强度低,可能由于脱水反应热力学方面的原因。

在对丹参素标准品进行电场强度梯度递增处理,同时进行裂解碎片的多级(五级)质谱分析时发现,丹参素是按照m /z 196.8→m /z 180.5→m /z 166.5→m /z 152.4→m /z 117.3过程进行裂解。

因此,推测丹参素的ESI 裂解行为如下所示:3.2　丹参素主要代谢产物的鉴定3.2.1　对照样品的分析　在2.2的分析条件下,对药品供试品溶液、空白血清、空白加样及含药血清供试品溶液进行了分析。

图2为其总离子流图,图3、图4、图5分别为药品供试品溶液、空白加样及含药血清供试品溶液中丹参素的全扫描一级质谱图。

与丹参素对照品一级质谱图相对比,可以看出在相同保留时间的片断(峰),二者的一级质谱图完全相同,这样即对此3种样品中的丹参素进行了定性分析。

3.2.2　含药血清样品的分析　对丹参素在人血清中的代谢产物进行了ESI 2MS 2分析。

图5为其全扫描一级质谱图,从图中可以看出,服药后血清样中除丹参素的准分子离子峰m /z 196.6及二聚体m /z 396.4存在外,相对丰度较大的峰主要有m /z 152.6、m /z 180.9、m /z 223.4、m /z 240.2,其中m /z 152.6、605 分析化学第33卷m /z 180.9在丹参素对照品的准分子离子峰m /z 196.8的二级质谱图中丰度较大。

与对照样品进行比较发现,对照样品的一级质谱分析中均未出现m /z 152.6、m /z 180.9,从而排除了基质对丹参素质谱裂解行为的影响以及滴丸中其他成分的干扰,因此推测m /z 152.6、m /z 180.9为丹参素的降解产物。

　图4　空白加样血清中丹参素的一级质谱图Fig .4　The ESI 2MS of Danshensu in blank seru m addedwith co mpound Danshen dri pp ing p ill 图5　给药血清样品一级全扫描质谱图Fig .5　The ESI 2M S of seru m sa mp le3.2.3　特征代谢产物质谱分析　(1)碎片离子m /z 223.4的多级质谱分析　选m /z 223.4为母离子进行多级质谱分析,其二级质谱碎片离子主要为m /z 59.3、m /z 120.2、m /z 179.1(图略)。

在进行电场强度梯度递增处理,同时进行裂解碎片的多级(五级)质谱分析时发现,该离子是按照m /z 223.4→m /z 179.1→m /z 120.2→m /z 59.3过程进行裂解。

因此,判断m /z 223.4的ESI 裂解行为是:(2)碎片离子m /z 240.2的多级质谱分析　选m /z 240.2为母离子进行二级质谱分析,其二级质谱碎片离子主要为m /z 87.7、m /z 116.8、m /z 151.6、m /z 180.6、m /z 196.1、m /z 223.3(图略)。

在进行电场强度梯度递增处理,同时进行裂解碎片的多级(五级)质谱分析时发现,该离子是按照m /z 240.2→m /z223.4→m /z 196.1→m /z 180.6→m /z 151.6→m /z116.8→m /z 87.7过程进行裂解。

推测m /z 240.2为丹参素在乙酰化酶作用下存在于人血清中的主要代谢产物,其形成碎片离子的断裂方式如右。

3.3　小结(1)采用柱切换高效液相色谱2电喷雾离子阱质谱(CS 2HP LC 2ESI 2MS n )联用技术,建立了复方丹参滴丸中丹参素及其代谢产物在人体内代谢过程的高效分析方法;(2)采用柱切换高效液相色谱技术可有效的去除干扰物质,富集待测物质,样品前处理简单,易705第4期裴渭静等:采用柱切换色谱2离子阱质谱联用法研究复方丹参滴丸中丹参素及其代谢产物 805 分析化学第33卷于实现自动化操作;本实验采用柱切换法分离富集了复方丹参滴丸中的丹参素,如适当改变一级和二级流动相亦可对其中的三七皂苷进行分离富集以及后续的分析,或者对同一样品中极性相差较大的多类成分同时进行分析;(3)可为药物在人其它体液中代谢产物的研究提供方法学参考。