乌桕D-12脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析

3 Expression patterns of Ssd12 in different tissues
Quantification real time RT-PCRs结果表明 结果表明Ssd12在所 结果表明 在所 有被测组织中都有表达活性。 有被测组织中都有表达活性。
在快速生长的组织如幼嫩的根和茎中Ssd12大量表达。因为生 大量表达。 在快速生长的组织如幼嫩的根和茎中 大量表达 长素参与了持家型∆12-FADs mRNA水平的上调，所以幼嫩组 水平的上调， 长素参与了持家型 水平的上调 织中膜的去饱和水平与细胞伸长有一定关系。 织中膜的去饱和水平与细胞伸长有一定关系。
4 Quantification real time RT-PCR
设计两对引物w121和w122、w18s1和w18s2 扩增Ssd12和18s 设计两对引物 和 、 和 扩增 和 rRNA基因，根据说明书将每个质粒 基因， 稀释10倍后 基因 根据说明书将每个质粒DNA稀释 倍后 5– 稀释 倍后(10 1010 copies/ul )制作这两个基因的标准曲线。利用实时荧光用 制作这两个基因的标准曲线。 制作这两个基因的标准曲线 iCycler iQ连续定量 连续定量PCR产物。用2-∆∆CT法分析荧光实时定量 产物。 连续定量 产物 PCR产物。 产物。 产物
6 Fatty acid analysis
提取酵母细胞总脂肪酸含量并加入甲醇使其甲基化，脂 提取酵母细胞总脂肪酸含量并加入甲醇使其甲基化， 肪酸甲酯(FAMEs)含量用 含量用CP-7638 GC和GC-MS分析,十 分析, 肪酸甲酯 含量用 和 分析 五酸甲酯作为内标。 五酸甲酯作为内标。
1 Cloning and characterization Ssd12 from Sapium sebiferum
18:1和18:2相比，Ssd12蛋白可能更倾向于以前者为 和 相比， 相比 蛋白可能更倾向于以前者为 底物，因为18:2在酿酒酵母中积累的更多。 在酿酒酵母中积累的更多。 底物，因为 在酿酒酵母中积累的更多 在酿酒酵母中，来自于乌桕的∆12-FAD识别两种底物 在酿酒酵母中，来自于乌桕的∆12-FAD识别两种底物 16:1和18:1，而来自于埃杜拉香菇 和 ，而来自于埃杜拉香菇(Lentinula edodes )、 、 被孢霉属(Mortierella fungus)和少根根霉 和少根根霉(Rhizopus 被孢霉属 和少根根霉 arrhizus)的∆12-FAD只识别一种底物 只识别一种底物(18:1)。造成这 的 只识别一种底物 。 一现象的原因还未知， 一现象的原因还未知，可能与不同的跨膜结构域的 拓扑结构有关。 拓扑结构有关。
BlastP 2.2.3 program分析表明 分析表明Ssd12的蛋白序列与拟南芥、 的蛋白序列与拟南芥、 分析表明 的蛋白序列与拟南芥 大豆、油桐的微粒体FAD2s的相似性分别为 的相似性分别为76%、 82%、 大豆、油桐的微粒体 的相似性分别为 、 、 90%，而与拟南芥、大豆的叶绿体的 ，而与拟南芥、大豆的叶绿体的FAD6s的相似性分别 的相似性分别 为21%和21%，表明该蛋白可能定位于内质网膜上。通过 和 ，表明该蛋白可能定位于内质网膜上。 TMHMM (version 2.0)分析表明该蛋白的两条长链疏水氨 分析表明该蛋白的两条长链疏水氨 基酸跨双分子膜四次。 基酸跨双分子膜四次。
本研究克隆了乌桕的Ssd12基因，并将该基因转入 基因， 本研究克隆了乌桕的 基因 酿酒酵母中鉴定其功能。 酿酒酵母中鉴定其功能。 1 Total RNA isolation
从乌桕的幼嫩种子、 从乌桕的幼嫩种子、根、茎和叶中提取RNA。用琼脂糖 茎和叶中提取 。 凝胶电泳及分光光度法测定RNA的质量和浓度，并储存在RNA的质量和浓度 凝胶电泳及分光光度法测定RNA的质量和浓度，并储存在 70℃以备 荧光实时定量PCR)用。 ℃以备RACE和Real time PCR(荧光实时定量 和 荧光实时定量 用
乌桕是双子叶大戟科植物， 乌桕是双子叶大戟科植物，是一种生长快速用途广泛 的热带和亚热带树种，根皮、树皮、叶均可入药， 的热带和亚热带树种，根皮、树皮、叶均可入药，种 子含油量高达41 47%，其中约有60%是不饱和脂肪 41– 子含油量高达41–47%，其中约有 是不饱和脂肪 酸，是工业用木本油料树种之一 。近年来的研究多集 中在利用基因操作来提高油脂化学品的含量。因此， 中在利用基因操作来提高油脂化学品的含量。因此， 要研究与贮藏脂质的合成及膜性质相关的脂质去饱和 作用的基因调控，首先要克隆和鉴定去饱和基因。 作用的基因调控，首先要克隆和鉴定去饱和基因。
2 Cloning of the full-length cDNA of Ssd12
以油桐和大豆基因序列的保守区设计引物12L2 和12R2 以油桐和大豆基因序列的保守区设计引物 来扩增cDNA的第一条链， 用三个通用引物 的第一条链， 用三个通用引物oligo(dT)18、 来扩增 的第一条链 AP1、AP2和五个特异引物 、 和五个特异引物1231、1232、1251、1252、 、 、 、 、 和五个特异引物 1253来扩增 来扩增Ssd12的3’和5’末端序列，用引物 末端序列， 来扩增 的 和 末端序列 用引物12L和12R扩 和 扩 增全长cDNA。PCR产物克隆到载体 产物克隆到载体pMD-18T上进行序 增全长 。 产物克隆到载体 上进行序 列分析。 列分析。
5 In summary
克隆了乌桕中∆12-FAD的cDNA全长，该基因产物与其他 的 全长， 克隆了乌桕中 全长 高等植物的这一基因产物有典型的结构同源性。 高等植物的这一基因产物有典型的结构同源性。在所有 检测的组织中， 在幼嫩的根和茎中大量表达。 检测的组织中，Ssd12在幼嫩的根和茎中大量表达。该研 在幼嫩的根和茎中大量表达 究也为今后乌桕中脂类去饱和的基因调控提供了依据。 究也为今后乌桕中脂类去饱和的基因调控提供了依据。
3 Southern blot analysis
法从5 幼嫩叶片中提取基因组DNA，用不同的限制 用CTAB法从 g幼嫩叶片中提取基因组 法从 幼嫩叶片中提取基因组 ， 酶消化DNA，0.8 %琼脂糖电泳分析。碱变性后将 琼脂糖电泳分析。碱变性后将DNA真空印 酶消化 ， 真空印 迹和紫外交联到带正电的尼龙膜上， 迹和紫外交联到带正电的尼龙膜上，全长 Ssd12 cDNA作为 作为 探针进行杂交，并用DIG探针进行杂交，并用 High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ试剂 盒标记。 盒标记。
5 Functional characterization of Ssd12 in yeast
用特异引物12ORF1和12ORF2扩增 和 扩增Ssd12的编码区，并 的编码区， 用特异引物 扩增 的编码区 克隆到pYES2.0上获得表达型 上获得表达型pYSsd12，通过测序来保 克隆到 上获得表达型 ， 证克隆产物的高保真性，并转化酿酒酵母菌株Invsc1。 证克隆产物的高保真性，并转化酿酒酵母菌株 。
4 Functional analysis of Ssd12 protein in yeast
气谱分析表明含有pYSsd12的酿酒酵母的脂肪酸甲酯 的酿酒酵母的脂肪酸甲酯 气谱分析表明含有 (FAME)的色谱图上有两个新的脂肪酸的峰 (FAME)的色谱图上有两个新的脂肪酸的峰，而这两个峰 的色谱图上有两个新的脂肪酸的峰， 在含空载体pYES2.0的酿酒酵母中没有找到。通过比较脂 的酿酒酵母中没有找到。 在含空载体 的酿酒酵母中没有找到 肪酸甲酯标准混合物的保留时间及气-质联用色谱分析， 肪酸甲酯标准混合物的保留时间及气-质联用色谱分析， 表明这两种新的脂肪酸甲酯的峰对应的脂肪酸是16:2和 表明这两种新的脂肪酸甲酯的峰对应的脂肪酸是 和 18:2，而16:1和18:1这两种脂肪酸含量降低。这些结果表 这两种脂肪酸含量降低。 ， 和 这两种脂肪酸含量降低 编码了∆12-FAD，将16:1和18:1分别转化为 分别转化为16:2和 明Ssd12编码了 编码了 ， 和 分别转化为 和 18:2。 。
Biotechnol Lett. (2007) 29:959–964
Cloning and characterization of a novel ∆12-fatty acid desaturase gene from the tree Sapium sebiferum
Introduction Materials and methods
以上结果表明Ssd12属于微粒体脱氢酶类，通过四个跨膜区 属于微粒体脱氢酶类， 以上结果表明 属于微粒体脱氢酶类 域定位在内质网膜上。 域定位在内质网膜上。
2 Genomic organization of Ssd12 in Sapium sebiferum genome
Southern blot分析表明乌桕基因组中 分析表明乌桕基因组中Ssd12至少有两个拷贝，与大 至少有两个拷贝， 分析表明乌桕基因组中 至少有两个拷贝 豆和向日葵中的结果类似。 豆和向日葵中的结果类似。
Results and discussion
பைடு நூலகம்
脂肪酸去饱和酶在生物体的脂肪酸代谢和生物膜 的构成中起着非常重要的作用。 的构成中起着非常重要的作用。它们的两种类型 分别是可溶型和膜结合型。膜结合型的∆ 分别是可溶型和膜结合型。膜结合型的 12FADs(∆ 12-fatty acid desaturase)催化油酸 催化油酸(18:1 ∆9) 催化油酸 转变为亚油酸(18:2 ∆9 ,12 )，并使之结合内质网膜 转变为亚油酸 ， (FAD2)或质体膜 或质体膜(FAD6)上，编码该酶的基因已经 或质体膜 上 在油桐(Vernicia fordii)、麻风树 (Jatropha curcas)、 在油桐 、 、 拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆 和大豆(Glycine max) 拟南芥 和大豆 中得到克隆。 中得到克隆。