Bradford法
布拉德福德测定法
布拉德福德测定法布拉德福德测定法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其基本原理是利用蛋白质中存在的酪氨酸与硫代硫酸钠发生氧化反应，生成酪氨酸硫酸盐的数量与蛋白质含量成正比。
下面为大家介绍一下布拉德福德测定法的相关参考内容。
测定原理布拉德福德测定法是一种比色法，在此之前，分析者要首先将样品进行前处理，使其能够与试剂反应。
一般来说，前处理方法包括二甲基亚砜（DMSO）处理、直接加入试剂溶液和醇萃取等。
在前处理完成后，将样品与布拉德福德试剂（也称为“G-250试剂”）混合后，等待反应达到平衡，然后使用分光光度计测定样品的吸光度值，最后与标准曲线对照计算蛋白质含量。
试剂制备布拉德福德试剂是由考马斯酸（Coomassie Brilliant Blue G-250）、甲醛和磷酸盐缓冲液组成的。
制备方法如下：将0.1 g的考马斯酸溶于50 ml的95%乙醇中，并用玻璃棒搅拌至完全溶解；加入1 ml的甲醛并充分混合；加入100 ml的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PH 7.0），并充分混合；用5%的乙醇调节至200 ml，并用纯水调节至1000 ml。
标准曲线制备标准曲线是布拉德福德测定法中必不可少的一部分，它能够帮助分析者根据反应的吸光度值推算出样品中蛋白质的确切含量。
制备方法如下：制定标准物质，如用碳酸钠进行稀释后的卵清蛋白（BSA）等；按照浓度从高到低顺序将不同浓度的标准物质与布拉德福德试剂按照1:4的体积比混合，使其反应，等待反应达到平衡，最后使用分光光度计测定吸光度值；制作标准曲线，将不同浓度的标准物质的吸光度值与浓度对照，可以得到一条线性趋势的曲线。
以这条曲线为基础，即可通过计算样品的吸光度值推算出其中蛋白质的含量。
测定注意事项在进行布拉德福德测定法测定时，需要注意以下几个方面：在样品前处理过程中要避免使用含有蛋白质的物质，以免干扰后续的测定结果；样品与试剂的比例要控制好，过低会导致样品中蛋白质的多少无法确定，过高则会测定结果的范围过窄；在进行试剂的混合时要慢慢地滴加，以免溶液产生泡沫导致吸光度值不稳定。
bradford法名词解释
bradford法名词解释
Bradford法是一种快速简便的蛋白质浓度测定方法，由Bradford于1976年建立。
它是利用蛋白质与考马斯亮蓝G250结合后颜色变化大，最大吸收峰移至595nm，消光系数大等特性进行测定的。
具体实验步骤包括标准曲线的制作和样品检测，使用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光度。
此法的优点是灵敏度高、测定快速简便、干扰物质少，但用于不同蛋白质测定时偏差较大，且有一些物质干扰此法的测定。
它是目前灵敏度最高的蛋白质测定法之一，广泛应用于生物检验领域。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
（一）凯式定氮法
原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催 化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与 硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根 据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
这是因为蛋白质与染料相结合后产生 的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有 更高的吸光系数 ,因而光吸收要比Folin –酚试剂法大得多。
(2)测定快速,简洁
只需要加一种试剂，完成一个样品 的测定，只要5分钟左右。由于染料与 蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即 可完成，其颜色可以在1小时内保持稳 定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的 稳定性最好。
(3)干扰物质少 一些阳离子如K+、Mg+、Na+和硫酸铵 等不干扰测定。
干扰物质：去污剂、 SDS、TritonX-100 、0.1 MNaOH
Bradford 法的缺点
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同 的标准蛋白。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质 有去污剂等。 (3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定 律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
缺点： 操作比较复杂、费时（8-10小时） 灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮测定。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
bradford法
双 缩 脲 法 （Biuret法）
中速 20~30 分 钟
多肽键＋碱性Cu2 ＋→紫色络合物
紫外吸收法
较为灵敏 50～100µg
快速 5～10分 钟
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 280nm 处 的 光 吸收 双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷
灵敏度高 ～5µg
慢速 40～60 分钟
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5µg
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时， 其 λ max 由 465nm 变为595nm
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适 用 于 0.2~ 1.0mg 氮 ， 误 差为 ±2％ 灵敏度低 1～20mg 费时 8～10小 时 将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定 非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离） 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长 用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
2、缺点 、
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进 行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝法完整版
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法
蛋白质的含量是指在样品中蛋白质的质量或浓度。
测定蛋白质含量是许多生物学和生化实验中常用的实验方法之一，以下是一些常见的测定方法：
1. 布拉德福德法（Bradford法）：该方法利用布拉德福德蛋白
质染料与蛋白质形成复合物，并产生特定的颜色，通过比色法测定颜色强度从而确定含量。
2. 低里氏法（Lowry法）：该方法基于在碱性条件下，蛋白质
与碱性铜离子复合生成紫色产物的原理，通过比色法定量测定。
3. BCA法（Bicinchoninic Acid法）：该方法利用BCA试剂与
蛋白质中的蛋白质产生螯合，形成紫色到蓝色的产物，并通过光度计测定吸光度从而测定含量。
4. 还原硝酸银法：该方法是通过硝酸银与蛋白质中的氨基酸中的硫原子反应产生黑色沉淀，通过沉淀的重量或者比色法测定吸光度来确定蛋白质含量。
5. 紫外吸收法：蛋白质具有特定的紫外吸收峰，在特定波长下进行测定，可以通过比较样品吸光度与标准曲线来计算蛋白质含量。
以上只是一些常见的测定方法，根据具体需要和实验条件的不同，可以选择适合的方法进行蛋白质含量的测定。
蛋白定量：BCA法丨Bradford法详情应用攻略
蛋白定量：BCA法丨Bradford法详情应用攻略蛋白定量BCA法，Bradford法，是2种常见的蛋白定量方法，关于这两种方法的原理，优缺点，以及操作步骤，下面将一一解析。
一、蛋白定量BCA（Bicinchoninic Acid）法BCA (bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。
在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，562nm处有zui高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
特点：灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。
需要注意的是这种方法需要提前制作标准曲线。
Abbkine定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，zui低检测蛋白量达到5ug。
实验所需仪器及试剂：恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管操作步骤：1.标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。
将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。
2.BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。
（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）3.加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。
在37°C下孵育30min，冷却至室温。
4.测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值5.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
Bradford法
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：1）Bradford储存液100ml95%乙醇200ml88%磷酸350mgServaG蓝室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液425ml双蒸水15ml95%乙醇30ml88%磷酸30ml Bradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：取样品即可测量。
注意事项：1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题，ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
Bradford法
蛋白含量的测定一、试剂1．试剂A：考马斯亮蓝G—250原液称取100mg考马斯亮蓝G—250溶于50mL 95%的乙醇，加入100mL 85%（W/V）磷酸。
2．试剂B：0.01%考马斯亮蓝G—250测定工作液将考马斯亮蓝G—250原液与双蒸水按15：85比例混匀，过滤。
4℃，棕色瓶保存。
3．0.1N 盐酸和双蒸H2O（新鲜备制，浓盐酸稀释120倍）4．蛋白标准液：10 mg/ml BSA蛋白溶液储液，将10mg BSA标准品溶于1mL水，室温稳定2小时，12,000g 离心10min，—20℃保存6—8月，—80℃保存1年。
将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。
12,000g离心10min后小量分装，—20℃保存6—8月，—80℃保存1年。
5．稀释液：待测样品的溶剂。
小量分装，—20℃保存。
6．待测样品（12,000g离心10min ）二、器材1．15mm*150mm试管；2．分光光度计；3．5ml、1ml、100 μl、10 μl取液枪4．Excel worksheet操作步骤1．标准曲线的测定（1）准备：将蛋白标准液、稀释液取出融解；考马斯亮蓝G—250测定工作液取出恢复室温；根据测定用量新鲜准备0.1N 盐酸和双蒸水。
（2）将9支干燥洁净的试管编号，按下表加入试剂，摇匀，室温放置半分钟后各管加入3.5ml 考马斯亮蓝G—250测定工作液, 摇匀，室温放置10min后，以0号管为空白调零测定其余各管595nm处相对吸光度。
管号0 1 2 3 4 5 6 7 8双蒸H2O/μL 80 70 70 70 70 70 70 70 70蛋白标准液/μL 0 10 10 10 10 10 10 10 10稀释液/μL 10 10 10 10 10 10 10 10 100.1NHCL/μL10 10 10 10 10 10 10 10 102．样品的测定（1）在一干燥洁净试管内，先加入80μL双蒸H2O，再加入用稀释液调整蛋白浓度到测定范围的样品10μL，加入0.1NHCL10μL混匀半分钟后，加入3.5ml考马斯亮蓝G—250测定工作液, 摇匀，室温放置10min后测定其在595nm处相对吸光度（2）同（1）操作，测定两个平行样，取其平均。
Bradford法测蛋白质浓度
Bradford法测蛋白质浓度一、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、试剂配制10ml标准蛋白溶液浓度：1mg/ml牛血清蛋白配置：用十万分之一天平称取0.01g牛血清蛋白(98%)倒入10ml容量瓶中，用0.15M NaCl溶液定容至10ml，室温下充分混合溶解1小时，10000rpm离心半分钟，取上清液。
500mL染色剂浓度：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇配置：用千分之一天平称取0.05g G250于烧杯中，加入25mL 95%乙醇，使用搅拌子搅拌，再量取50mL 85%的磷酸溶液，最后去离子水定容至500mL。
配好后用Whatman1号滤纸过滤。
保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。
二、保存条件保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。
三、实验过程1.提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪2.配制蛋白标准溶液先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.4mg/ml ，0.2mg/ml，0.1mg/ml的BSA溶液100μL，计算稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
bradford法原理
bradford法原理Bradford法原理是一种用于图书馆和信息管理领域的信息检索方法，它的目标是通过评估文献的相关性来提供对用户查询的最佳响应。
该原理是由Samuel C. Bradford于1934年提出的，他的研究发现了一个特定的分布模式，即"核心文献"与其他相关文献的关系。
Bradford法原理的核心思想是将文献分为三个区域，以便更好地组织和管理信息。
这三个区域分别是核心区、首层区和次层区。
核心区包含与用户查询最相关的文献，这些文献通常是最具权威性和独特性的。
首层区包含与核心区文献相关的文献，它们可能更一般或更具体。
而次层区则包含与首层区文献相关的文献，这些文献可能更具一般性。
Bradford法原理的关键在于确定文献之间的相关性。
为了实现这一点，研究人员会进一步将文献分为不同的主题或领域，并将其组织成分类系统。
这样一来，当用户进行查询时，系统可以根据用户的需求从不同的区域中选择相关的文献进行检索。
通过这种方式，用户可以更快地找到他们所需的信息，并且可以获得更全面和准确的结果。
Bradford法原理的应用不仅局限于图书馆和信息管理领域，它还可以在其他领域中发挥重要作用。
例如，在市场研究中，研究人员可以使用Bradford法原理来确定与某个产品或服务最相关的市场细分。
在医学研究中，研究人员可以使用Bradford法原理来确定与特定疾病或治疗方法相关的最重要的文献。
尽管Bradford法原理在信息检索领域有着广泛的应用，但它也存在一些限制。
首先，它假设文献的相关性是可度量的，并且可以通过某种方法来确定。
然而，在某些情况下，文献之间的相关性可能是主观的，并且可能因不同的评估标准而有所不同。
其次，Bradford 法原理的应用需要一个完善的文献数据库和分类系统，这在某些领域可能是有限的或不可行的。
最后，由于信息的不断更新和增长，Bradford法原理可能需要不断调整和优化，以适应不断变化的信息需求。
蛋白定量3法-药典
考马斯亮蓝法（Bradford法）本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度高，通常可测定1〜200μg的蛋白质量。
本法主要的干扰物质有去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS)等，供试品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。
试剂酸性染色液取考马斯亮蓝G250 0.lg，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。
滤过，取滤液，即得。
本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。
对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白(牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每l ml中含l mg的溶液。
供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
测定法精密量取对照品溶液0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml (对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各加水至0.1ml，再分别加人酸性染色液5.0ml，立即混匀，照紫外-可见分光光度法（通则0401) ，立即在595nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。
以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。
另精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
【附注】本法测定时不可使用可与染色物结合的比色皿（如石英比色皿），建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。
加入后5-20min线性关系最好，干扰物质少,K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法.法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差.（2）仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH.（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）.紫外-可见分光光度法本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280m波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。
bradford法测蛋白浓度原理
bradford法测蛋白浓度原理Bradford方法是一种用于测定蛋白质浓度的实验室和常规医学检测方法，也称为Bradford试剂盒试验，它是由美国科学家Marion M. Bradford在1976年提出的，主要应用于生物医学、药物学、食品学和其他分子生物学领域。
Bradford法是一种快速灵敏的比色分析方法，可以测定蛋白质的浓度，这也是它的高效性的一个很大原因。
Bradford试剂由Bradford发明，由一种特定的酶蛋白原料制成，它可以与任何一种类型的蛋白质反应，从而生成一种特殊的比色物质。
当把Bradford试剂添加到蛋白质溶液中时，会发生一种特殊的化学反应，其后积累的颜色称为Bradford比色，可用来测量蛋白质的浓度。
Bradford法比色的原理是利用蛋白质与Bradford试剂中的色原分子在反应过程中形成一种新的比色物质，经光度切换实现颜色变化，从而能够准确的测量蛋白质的浓度。
Bradford法的优点是结果可靠，结果准确、快速，因此它是许多日常实验室检测中最常用的分析方法之一。
Bradford法可用于多种蛋白质的测定，但最常用的是白蛋白、胆红素和伽马蛋白等血液分析中的参数测定，也可以用于检测其他蛋白质过表达和表达水平。
Bradford试剂盒在使用时，必须先进行标准曲线和检测物质样本的光谱吸收率测定，以确定准确的光吸收峰值，以及浓度与吸光度的关系。
通过该关系可以计算检测物质的浓度。
Bradford方法的缺点是检测的灵敏度相对较低，由于其体系中的基础参数不同，因此在不同实验室中可能存在差异，这就需要实验者在进行检测时，仔细调整和校准实验参数，以确保实验结果的可靠性。
总之，Bradford方法是一种简便、准确、快速、经济的比色分析方法，它可用于生物医学、药物学、食品学和其他分子生物学领域，用于测定各种蛋白质的浓度。
如果正确使用，Bradford方法能够为实验室提供准确的结果，同时也能为医学和其他领域的研究和检测提供有效的解决方案。
布拉德福德测定法
布拉德福德测定法布拉德福德测定法是一种常用的实验方法，用于测定微生物的总数。
此方法基于微生物菌落的形成和增殖，通过计数菌落的数量来推断微生物的总数。
实施布拉德福德测定法需要以下实验材料和步骤。
实验材料：1. 培养基：常用的培养基有营养琼脂、平板培养基等。
2. 细菌培养物：待测微生物的培养物。
3. 灯笼瓶或两个斜面瓶：用于培养细菌。
4. 称量瓶和称量纸：用于称取微生物培养物。
实验步骤：1. 准备培养基：根据所需的实验目的，选择合适的培养基材料，并按要求制备培养基。
2. 准备培养室和操作区：实验室应保持清洁，准备好所需的消毒酒精和洗涤剂等。
3. 配制微生物培养物：根据实验需求，选择合适的微生物培养物，并按照制备方法配制。
4. 培养微生物：将微生物培养物均匀涂布在培养基表面或注入培养基中，放入灯笼瓶或斜面瓶中培养。
5. 培养菌落：培养一定时间后，菌落会在培养基上形成。
菌落的形成时间因微生物种类而异。
6. 统计菌落数：取适量培养基，用计数板或其他适当方法统计菌落的数量。
对于大量的菌落，推荐选择分区计数法。
7. 计算菌落总数：根据菌落数量和相应的转换因子，计算出菌落总数。
转换因子是由研究人员根据经验得出的，它可以将已经统计的菌落数转换成微生物的总数。
需要注意的是，布拉德福德测定法的准确性受多种因素影响，例如培养基的成分、温度、湿度和培养时间，以及方法操作的技术性和个体差异等。
因此，在进行布拉德福德测定法时，应遵循标准操作流程并控制实验条件的一致性，以获得可靠的结果。
总之，布拉德福德测定法是一种简单有效的微生物总数测定方法。
通过统计菌落数量，并应用相应的转换因子，可以快速推断出微生物的总数。
植物蛋白质的测定方法
植物蛋白质的测定方法
测定植物蛋白质的方法可以包括以下几种：
1. Kjeldahl法：该方法是目前最常用的测定总蛋白质含量的方法。
它是基于氨基酸中的氮元素能够通过酸水解得到氨气，再通过凝集器和酸中和溶液收集氨气来测定氨气的体积，从而计算出样品中的氮含量，再乘以一个经验因子来估算样品中的蛋白质含量。
2. Bradford法：该方法是一种常用的蛋白质含量测定方法。
它
是基于蛋白质与康斯塔蓝染料形成复合物后，会改变染料的吸收光谱特性的原理。
通过测量染料在特定波长下的吸光度变化，可以间接计算出样品中的蛋白质含量。
3. Lowry法：该方法是一种比较敏感的测定蛋白质含量的方法。
它是基于蛋白质与碱式铜离子和费林试剂反应后形成紫色沉淀的原理。
通过测量沉淀的吸光度，可以间接计算出样品中的蛋白质含量。
4. BCA法：该方法是一种比较灵敏的测定蛋白质含量的方法。
它是基于蛋白质与BCA试剂中的铜离子反应产生蓝色比色产
物的原理。
通过测量比色产物的吸光度，可以间接计算出样品中的蛋白质含量。
总结起来，常用的测定植物蛋白质含量的方法包括Kjeldahl法、Bradford法、Lowry法和BCA法。
这些方法各有优缺点，根
据实验需要和样品特点选择合适的方法进行测定。
蛋白质标准
蛋白质标准
蛋白质标准通常用于衡量或评估食品、生物学样品或其他物质中的蛋白质含量。
以下是一些常见的蛋白质标准和相关的测定方法：
1.氮测定法：蛋白质通常包含氮元素，因此测定样品中的氮含量
可以用于估算蛋白质含量。
常用的氮测定法包括Kjeldahl法和Dumas法。
2.Bradford法：Bradford法是一种颜色反应法，通过蛋白质与
Bradford试剂反应产生颜色，根据颜色的强度来估计蛋白质的含量。
这种方法对蛋白质含量较高的样品比较敏感。
3.Lowry法：Lowry法也是一种基于颜色反应的测定方法，与
Bradford法类似，但相对较为灵敏，适用于较低蛋白质浓度的样品。
4.BCA法（双硫键-联苯胺法）：BCA法是一种基于联苯胺与蛋
白质反应产生颜色的方法，用于测定蛋白质浓度。
5.Biuret法：Biuret法是一种根据蛋白质与Cu^2+形成的Biuret
复合物的紫色产物的强度来测定蛋白质含量的方法。
6.UV吸收法：在280纳米波长处，蛋白质中的芳香族氨基酸（如
酪氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）具有特征性的吸收峰。
通过测量UV吸收强度，可以估算蛋白质含量。
7.荧光法：蛋白质在紫外光激发下产生荧光，测定荧光强度可用
于估算蛋白质含量。
标准样品通常用于校准这些测定方法，确保测得的蛋白质含量是
准确可靠的。
常见的蛋白质标准物质包括卵清蛋白、牛血清蛋白等。
具体选择哪种方法和标准取决于实验的目的、样品的性质和要求的灵敏度。
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原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：1）Bradford储存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG蓝
室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液
425ml双蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford储存液
用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做标准曲线：
取样品即可测量。
注意事项：
1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题，ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
一、实验原理
双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
bradford法的突出优点是：
1. 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
3. 干扰物质少。
如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。
（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）。
3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
二、试剂与器材
1. 试剂：
①标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0. 1mg/ml的标准蛋白质溶液。
②考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 9 5%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
①可见光分光光度计
②旋涡混合器
③试管16支
三、操作方法
1. 标准方法
①取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1 ml。
最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
②加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在59 5nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlg—2 50试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。
由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,，空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
(二)试剂与器材
1.试剂:
(1)标准蛋白质溶液，用g�球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0. 1mg/ml的标准蛋白质溶液。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2.器材:
(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)试管16支
(三)操作方法
1.标准方法
(1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。
最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。
未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
(2)加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在59 5nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG-25 0试剂。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。
由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2.微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml)，可将取样量(包括补加的水)加大到0. 5ml或1.0ml，空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O，考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。