细胞迁移和侵袭实验技术 ppt课件
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径与经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster与Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM与1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤与流程2、1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2、2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响。
但这一步并不就是必须的。
②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1－2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2、3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
肿瘤侵袭与转移ppt课件
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
附表 骨髓和区域淋巴结中ITC的检测与 原发性肿瘤部位的关系
原发性肿瘤
骨髓检出率
肾癌 乳腺癌 胃癌 结-直肠癌 前列腺癌 非小细胞肺癌 胰腺导管癌 食管癌
引自Hermenek(1999)
~20% ~30% ~30% ~30% ~35% ~50% ~50% ~40%
区域淋巴结 检出率
~15% ~90% ~50% ~45% ~15% ~75% ~50%
20
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
1. 整 合 素 α2β1 （ VLA-2 ） ， α3β1 （ VLA-3 ） ， α5β1 （ VLA-5 ） 和 α6β1 （ VLA-6 ） 在 癌 细 胞 表达的改变（增加或减少），视具体 的癌瘤而定。
2.E-cadherin在癌细胞的表达程度与癌 细胞的侵袭转移潜能呈负相关。
3.CD44 在多种高转移性癌细胞上呈 高表达。
1
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
肿瘤转移 恶性肿瘤细胞从原发部 位侵入淋巴管，血管或体腔，迁徙至靶 组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续 而组织学类型相同的肿瘤，这个过程称 为转移。前者称为原发瘤，后者称为转 移瘤或继发瘤。
成成份：各型胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白 和蛋白聚糖。 ECM降解酶系统包括五类降解酶，其中以基质 金 属 蛋 白 酶 （ matrix metalloproteinases,MMPs）最为重要。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
细胞迁移和侵袭实验检测方法和原理
细胞迁移和侵袭实验检测方法和原理细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。
细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。
细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。
胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
细胞侵袭（cell invasion）是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力。
细胞侵袭是正常细胞和癌细胞应对化学和机械刺激的反应。
在迁移到新区域之前，细胞外基质被细胞内的蛋白酶降解。
细胞侵袭常发生于伤口修复、血管形成和炎症反应以及组织的异常浸润、肿瘤细胞转移等过程中。
技术原理检测细胞迁移能力和侵袭能力常用的实验手段是Transwell实验。
Transwell顾名思义是“穿孔实验”，即将小室放入孔板中（常见的是24孔板），小室中含有密密麻麻的小孔，将细胞悬液加到小室中，小室放在加入完全培养基的24孔板内，细胞可通过形变穿过小室中的孔而跑到营养更丰富的小室外部并贴在外侧。
通过对小室外部的细胞进行染色计数，就可以判断细胞的迁移与侵袭能力的强弱。
Transwell的基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。
将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。
常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。
1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。
1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。
ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。
但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。
ﻫ２。
3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
细胞生物学中的细胞迁移和侵袭
细胞生物学中的细胞迁移和侵袭细胞迁移和侵袭是细胞生物学中重要的研究领域，涉及到细胞的移动能力以及其对周围环境的感应和相应。
在生物体内，细胞迁移和侵袭现象的产生和调控对于多种生理和病理过程至关重要，如胚胎发育、癌症转移等。
一、细胞迁移的基本机制细胞迁移是指细胞从一个位置移动到另一个位置的过程。
丰富的细胞外基质提供了细胞迁移所需的支持和信号。
此过程主要通过细胞骨架的重塑、胞质流动以及细胞-基质和细胞-细胞相互作用等方式实现。
细胞迁移可分为单个细胞迁移和细胞团体迁移两种形式。
1. 单个细胞迁移单个细胞迁移可分为装袋型和伸长型两种形式。
装袋型迁移常见于平滑肌、炎症细胞等。
伸长型迁移则是癌细胞等能够产生突触和细胞突出的细胞类型常见的迁移方式。
在细胞迁移过程中，细胞通过细胞外基质附着与解附的反复过程，从而实现细胞的持续迁移。
2. 细胞团体迁移细胞团体迁移包括单重上皮层远离或边缘移位、管腔内的迁移以及某些情况下的胚胎发育等。
细胞团体迁移通常通过多个细胞的集体协作实现，其中细胞间紧密相连，通过细胞骨架和细胞-细胞相互作用等方式协同运动。
二、细胞侵袭的调控和机制细胞侵袭是指细胞能够穿过间质，进入周围组织的过程。
正常生理条件下，细胞侵袭主要发生在组织重塑和损伤修复过程中。
而在某些病理情况下，如癌症转移，细胞侵袭能力的增强至关重要。
1. 调控细胞侵袭的信号通路细胞侵袭能力的调控受到多个信号通路的参与，如Wnt信号通路、Notch信号通路、TGF-β信号通路等。
这些信号通路可通过调节细胞骨架的重塑、细胞外基质附着和解附、细胞间相互作用以及细胞运动的速度等方式来影响细胞的侵袭能力。
2. 细胞外基质在细胞侵袭中的作用细胞外基质是细胞迁移和侵袭过程中的重要组成部分。
具体来说，细胞外基质可以提供适宜的机械支持，通过与细胞表面受体相互作用来调控细胞的附着和解附过程，同时也可释放一系列信号分子来激活相关信号通路。
这些信号通路的活化有可能进一步调控细胞的运动和侵袭能力。
细胞迁移和侵袭能力测定
细胞迁移和侵袭能力测定细胞迁移性测定①常规消化细胞，用无胎牛血清的DMEM 培养基洗细胞3次，配制细胞悬液，调整浓度为5×105细胞/ml，于Transwell 小室（见图B）的上室中加入不同的细胞悬液（MDA-MB-231/syk 、MDA-MB-231/pcDNA3.1 和MDA-MB-231）200 μl，每组设3 个复孔。
②下室加入600 μl 含50 ml/L 胎牛血清的DMEM 培养基。
③37℃，5% CO2培养箱中孵育20~24 h。
④滤膜上的微孔允许肿瘤细胞穿越，迁移的细胞可黏附于膜下层，取出Transwell 小室，用PBS 洗2 遍，棉拭子擦去膜上面未迁移的细胞，计数并比较穿过膜的细胞数，可在一定程度上反应肿瘤细胞的迁移能力。
⑤细胞显色：95%乙醇固定Transwell 小室上的聚碳酸酯滤膜30min，PBS 冲洗2 次，每次3 min 苏木精染色5.5 min，自来水冲洗1~2 min 1%盐酸酒精分化数秒钟，自来水冲洗1~2 min 伊红染色80 s，自来水冲洗1~2 min 梯度乙醇脱水：70%乙醇10 s，80%乙醇10 s，90%乙醇 1 min，95%乙醇1 min，无水乙醇15 min 将滤膜撕下来，有细胞的一面向上放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂封片在400 倍高倍镜下记数，每张片子随机记录 5 个视野的迁移细胞数，将 5 个数值加起来表示迁移细胞数细胞侵袭试验①基质胶的准备：将冻存于-20℃冰箱的Matrigel 胶4℃放置过夜，变成液态。
并预冷枪头。
②用400 μl 无胎牛血清DMEM 培养基稀释50 μl Matrigel胶原液（1:8稀释），混匀（冰上操作）。
向Transwell 小室的上室中分别加入50 μl 稀释液，放入37℃培养箱中孵育4~5 h，此间经常观察，当出现“白色层”时，说明Matrigel 胶已变为固态。
③加100μl无血清培养基浸润凝固的胶，吸弃，后续步骤与迁移实验相同。
长链非编码RNALINC01116通过AGO1调控食管鳞癌细胞迁移和侵袭演示课件
胞侵袭能力的影响。
对照组（空载体转染）
02
将空载体转染至食管鳞癌细胞中，作为实验组的对照，以排除
转染本身对细胞侵袭能力的影响。源自AGO1抑制组03
在过表达LINC01116的同时，抑制AGO1的表达，以探究
LINC01116是否通过AGO1调控食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。
结果分析与讨论
LINC01116过表达对食管鳞癌细胞侵 袭能力的影响：实验组细胞的侵袭能 力显著高于对照组，表明LINC01116 过表达能促进食管鳞癌细胞的侵袭。
长链非编码RNA在食管鳞癌中作用机制总结
要点一
长链非编码RNA在食管鳞癌中的 表达特征
总结长链非编码RNA在食管鳞癌中的表达特征，包括表达 水平、表达模式以及与临床病理特征的关系等。这些特征 有助于深入了解长链非编码RNA在食管鳞癌发生发展中的 作用。
要点二
长链非编码RNA通过AGO1调控 食管鳞癌细胞迁移和侵袭…
不同浓度处理组
设立不同浓度的长链非编码 RNALINC01116或AGO1处理组 ，观察浓度变化对细胞迁移能力 的影响。
不同时间处理组
设立不同时间点的长链非编码 RNALINC01116或AGO1处理组 ，观察时间变化对细胞迁移能力 的影响。
结果分析与讨论
数据统计与分析
对实验数据进行统计分析， 包括细胞迁移距离、迁移细 胞数量等指标的测量和比较
05
CHAPTER
分子生物学机制探讨
LINC01116对AGO1表达调控作用研究
LINC01116表达与AGO1表达相关性分析
通过实时荧光定量PCR等技术，检测食管鳞癌组织中LINC01116和AGO1的表达水平，并分析二者之间的相关性 。结果表明，LINC01116的表达与AGO1的表达呈正相关，提示LINC01116可能参与调控AGO1的表达。
细胞迁移和侵袭实验的区别
细胞迁移是细胞在化学信号（如：趋化因子）的驱使下沿着浓度梯度从一个区域转移到另一区域的运动。
细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度驱使下完成从一处到另一处的移动。
从名字来看，这两种行为既有联系又有区别——迁移是在没有阻力的情况下的细胞移动，但侵袭则需要裂解“阻力”后才能实现移动能力。
简单总结就是，细胞侵袭是一种特殊的细胞迁移，侵袭细胞具有迁移能力，但并非所有的迁移细胞都具有侵袭性。
一、细胞迁移细胞迁移(cell migration)也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。
细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。
细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。
胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
细胞迁移的过程大致可以分为4步：①细胞前端伸出片状伪足；②细胞前端伪足和细胞外基质形成新的细胞黏附；③细胞体收缩；④细胞尾端和周围基质黏着解离，细胞向前运动。
细胞迁移需要胞外、胞内信号分子调控细胞骨架动力装置所给予的驱动力与肌动蛋白细胞骨架介导的黏附所提供的锚定力之间的协调运作。
目前，细胞迁移基本在细胞培养物中进行，主流的方法有：Boyden小室（跨膜法）、间隙封闭分析等；其中，Boyden小室可用于分析贴壁或不贴壁细胞，并可检测趋化梯度下的迁移，但这种方法不适用实时动态迁移；间隙封闭分析则可以对细胞迁移进行实时监测，甚至可有实现三维细胞的迁移分析，其缺点是不能分析不贴壁细胞和趋化梯度下的迁移。
因此，可以根据实际情况进行实验方案的设定。
同时，细胞划痕也可以测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell 迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS 结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
癌细胞转移与浸润PPT课件
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癌细胞浸润
• 人体浸润---人体组织内侵入了异常细胞或出现了正常情况下不应出现的机体细胞，以及某些病变 • 癌细胞浸润---细胞可以转移到其他组织中，并在其他组织中继续分裂繁殖，也就是癌细胞转移。
• 1、Transwell小室制备（细胞浸润实验所需，迁移实验无此步骤） • （1）包被基底膜 • （2）水化基底膜
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细胞浸润实验
• 2、制备细胞悬液，具体细胞密度需要通过多次实验自己摸索。 • 3、细胞接种到transwell小室中，含趋化因子的培养基加入细胞培养板中。 • 4、细胞培养12-48小时（主要依癌细胞迁移及侵袭能力而定）。
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肿瘤
• 上皮组织良性肿瘤--腺瘤 • 上皮组织良性肿瘤--腺瘤 • 上皮组织恶性肿瘤--鳞状细胞癌—— • 上皮组织恶性肿瘤—腺癌 ——癌细胞 • 上皮组织恶性肿瘤--基底细胞癌—— • 间叶组织良性肿瘤--脂肪瘤 • 间叶组织良性肿瘤--血管瘤
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浸润与转移
• 具有局部浸润和远程转移能力是恶性肿瘤特有的性质它是引起患者死亡的的主要原因，研究肿瘤浸润和转 移机制对临床治疗有十分重要的意义。
肿瘤细胞与癌细胞的区别
• 肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，在恶性肿瘤中，有上皮分化而来的称为癌，由间叶组织分化而来称为肉瘤。 • 癌是起源于上皮细胞的分化程度低 恶性程度高的恶性肿瘤细胞。 • 癌细胞是恶性肿瘤的一种。
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分化程 度 核分裂
生长速 度 生长方 式 继发改 变 转移 复发 对机体 影响
侵袭和迁移系统
• BD Falcon™ 24 or 96-孔FluoroBlok™8微米培养小室 • 预包被Matrigel基质 • 与内皮细胞侵袭类似（3微米）
主要特点
•提高肿瘤细胞侵袭实验的通量 •自动化非破坏式的荧光检测 •节约抗肿瘤转移药物筛选的时间和劳动力 •高度可重复性：平均Z‘=0.7(24孔) 平均Z’=0.66 （96孔） •使用简便：无需反复取液和操作，仅需加入细胞、标记物，直 接读板 •与大部分荧光检测仪和流式分析仪器兼容 •高信噪比
TUMOUR INVASION SYSTEMS
BD BioCoatTM肿瘤侵袭系统
透射电镜图显示Matrigel均匀地包被于PET膜表面
细胞消化BD Matrigel™基质，穿过膜
底层膜电镜图显示细胞发生了跨膜侵袭
BD BioCoatTM肿瘤侵袭系统
MDA-MB-231 人乳腺癌细胞侵袭实验
其他相关应用
• Matrigel基本组成
• • • • 赖氨酸 ~60% IV胶原蛋白 ~30% 巢蛋白~8% 其他：蛋白多糖，生长因子，多种金属蛋白混合物等
血管形成实验的关键点---细胞来源
• HUVEC人脐静脉内皮细 胞是内皮细胞血管形成实 验最常用的细胞 •细胞来源，分离过程，和 原始培养条件都是实验的 影响条件
孔径选择和不同应用
孔径选择和不同应用
• • • 0.4μm透明型
• 扫描及透射电镜；光镜下活细胞的观察；免疫组织化学染 色
0.4 μm高密度半透明（孔多）型
• 小分子的运输，扩散和分泌；TEER屏障功能检测；药物 生物活性（生物利用度）检测
1.0 μm透明型
• 光镜下活细胞生长的观察，分子的运输，扩散和分泌；免 疫组织化学染色；药物生物活性检测。防止细胞穿孔迁移 的最大孔径
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ppt课件
操作步骤
4．放入37℃ 5% CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞 运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。
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操作步骤
5. 数据处理：每个时间点的距离长度-0 时距离=每个时间长 度细胞整体迁移的距离，求出均数和标准差，时间为横轴， 迁移距离为纵轴（单位mm）作图，并比较初始0 时与实验 结束时实验组与对照组的照片。
碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3 次后 再蘸取一次，晾干； 6. 固定, 染色
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实验步骤
7. 取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片； 8. 显微镜观察计数，每孔至少 3 个随机视野，3 个孔的数值
取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别； 9. 趋化指数(Chemotaxis Index)=随着趋化诱导因子的浓度
5×105/ml； 3. 加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，
光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上
拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3 个孔；
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实验ห้องสมุดไป่ตู้骤
4. 将趋化小室在 37℃，5% CO2 的孵化箱中孵育3h； 5. 在膜的两端加上夹子，毛面在PBS 液面上蘸取，光面禁止
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肿瘤细胞运动实验技术
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肿瘤细胞运动
体内实验： 皮下移植瘤模型 原位移植瘤模型
体外实验
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划T痕e实xt验 in here
侵袭实验
趋化运动
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肿瘤细胞运动 常用研究方法
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划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay） 实验原理
细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方 法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然 后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移 的影响。
Transwell 小室
0.4um孔径聚碳 酯膜的扫描电镜
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原理
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人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃ 时是液体，在37 ℃ 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连 蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结
构与天然基质膜结构极为相似。
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原理
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滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞 不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过 这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
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微孔小室中的趋化实验
微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞， 中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定 孔径的滤膜而设计的。
滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞 在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细 胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面 的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。
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实验步骤及注意事项
3. 每孔加入 200ml 1640（或DMEM）培养基使胶重构；
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Cell Numbers/HPF
100 80 60 40 20 0 scr
EGF(ng/ml)
0
***
1
10
100
#1
#2
#3
MDA-MB-231
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肿瘤细胞侵袭试验
Matrigel Invassion Assay
Transwell 系统
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操作步骤
1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划 横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿 过3条线。
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操作步骤
2. 在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类 不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；
3.用10ml tip 枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS 洗 涤2 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。
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注意事项
1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁 细胞，影响实验拍照结果。
2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖 就不能忽略。
3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作 为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。
梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目
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注意事项
1. 膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生； 2. 放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。 3. 枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5 处，迅速加样，不要迟
疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离 开液面。 4. 洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。
Transwell 电镜图片
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实验步骤及注意事项
1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或DMEM only 培养基） 稀释成1mg/ml 浓度，-20°C 冻存备用；
2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50ml 的体积铺于Tramwell 小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸 酯膜浸湿为最好），37°C 放置lh，使Matrigel 聚合成凝胶（注意： 加基质胶时最好将24 孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不 要有气泡）；
4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同 的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培 养时间，保证培养终止时密度适当。
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趋化运动实验（Chemotaxis Assay） 实验原理
趋化运动是指细胞能够感受到外界化学物质的 浓度梯度，并沿着浓度梯度的方向所做的定向运动。 趋化运动是一个非常保守的过程，对于生物体的生 存、生命的繁衍等具有重要的意义。
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Boyden Chamber 装置
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实验步骤
1. 在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度
的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3
个孔，其中只加BM的孔为阴性对照； 2. 取对数生长期细胞，0.1%BM 重悬细胞，调整细胞浓度为