17-第五章 培养基及设备的灭菌
培养基配置和灭菌的注意事项
培养基配置和灭菌的注意事项一、培养基配置1.选用适当的培养基组成：根据实验的需要选择适当的培养基成分，包括碳源、氮源、矿质盐、维生素等。
根据不同微生物的要求，可以选择不同的培养基，如富集培养基、选择性培养基等。
2.正确计量和混合培养基成分：根据实验需要和比例，精确地称取和混合培养基成分。
注意避免污染和交叉污染，使用干燥器、称重纸和清洁器具等进行操作。
3.正确调节培养基的pH值：根据不同微生物的偏好，调节培养基的pH值。
使用pH计和相应的酸碱溶液进行调节，确保培养基的pH值符合微生物的需求。
4.加热溶解和固化培养基：将培养基成分加入适量的蒸馏水中，加热搅拌溶解，然后分装到培养皿或试管中。
对于固化培养基，需要加入适量的琼脂或琼脂糖，在混合均匀后加热至溶解，然后分装到培养皿或试管中。
二、培养基灭菌1.选择合适的灭菌方法：有常见的三种灭菌方法，包括热处理（如蒸汽灭菌、热风灭菌）、化学灭菌和滤器灭菌。
根据实验需求和培养基的性质选择合适的灭菌方法。
2.准备合适的灭菌器具：根据实验需求和培养基的量，选择合适的灭菌器具，如蒸馏锅、高压灭菌器、紫外线灭菌箱等。
3.正确操作灭菌设备：根据灭菌设备的说明和操作指南，正确操作和调节灭菌设备。
4.合理选择灭菌时间和温度：根据不同培养基的特性和实验需求，合理选择灭菌时间和温度。
通常情况下，蒸汽灭菌的时间为15-30分钟，温度为121摄氏度；热风灭菌的时间为1-2小时，温度为160摄氏度。
5.注意灭菌后的处理：在灭菌后，及时关闭灭菌设备，避免灭菌后的污染。
将培养基冷却后，进行温度验证，然后保存在合适的温度和条件下。
培养基和灭菌
1、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、
硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝 酸钾）和氨水等。
特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用；
（2）引起pH变化。
(NH4)2S04 →2NH3+H2S04
生理酸性物质
NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH 生理碱性物质
2、有机氮源（慢速利用氮源，多为天然有机 物） ：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋 白粉，蛋白胨，酵母膏。
2、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化 过程速率增快。
3、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一般 用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。
（三）湿热灭菌
1、方法： 直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器 的灭菌。用蒸汽将物料升温到115－140℃保持一 定时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是 120℃，20－30min。
P、S（可构成细胞物质） Mg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性） K、Na（调节细胞渗透压） Cu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）
四、 水：
（1）构成生物体的成分； （2）培养基的组成部分； （3）参与代谢反应； （4）作为代谢反应介质； （5）作为物质传递介质； （6）良好的热导体。
染菌对抗生素生产过程的危害： （1）消耗培养基的营养成分； （2）使培养条件如溶氧、粘度发生变化； （3）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或
能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量 大幅度下降； （4）影响后道工序的正常生产、影响产品外观及 内在质量； （5）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶， 而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。
(整理)发酵工程原理与技术江南大学-陈坚-5
第五章培养基及设备的灭菌第一节培养基灭菌的目的、要求和方法一、定义1，培养基灭菌的定义是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。
工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。
2，灭菌与消毒的区别灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。
二、培养基灭菌的目的1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难；杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。
2，工业上具体措施包括（1）使用的培养基和设备须经灭菌；（2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；（5）使用无污染的纯粹种子。
3，培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。
4，培养基灭菌的要求（1）达到要求的无菌程度（10-3）（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
5，灭菌的方法（1）化学法化学药品灭菌法（2）物理法干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法6，湿热灭菌的原理每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。
当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。
当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。
7，湿热灭菌中的相关定义杀死微生物的极限温度称为致死温度。
在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。
第五章灭菌
由于多种微生物的存在，对于培养基灭菌， 取耐热性芽孢杆菌的κ值进行计算。这时， 可以取A=1.34×1036s-1, △E=2.844×105J/mol，则
lg k 14845 36.127 T
（6-5）
由式（6-2），得理论灭菌时间的计算式: （6-6） 1 N0 ln k Ns
（5）发生噬菌体污染时，微生物细胞被裂解
纯种培养的措施
（1）将培养基和设备进行灭菌 （2）将空气经除菌处理
（3）设备应严密，且维持一定的罐压
（4）加入的物料应灭菌 （5）使用无污染的纯粹种子
5.1
灭菌的方法
1．化学试剂灭菌法 某些化学试剂能与微生物发生反应而具有杀菌 作用。 常用的化学试剂有甲醛、氯气(或次氯酸钠)、高 锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐等，但由于化学试剂 也会与培养基中的一些成分作用，且加入培养基 后易残留在培养基内，所以不用于培养基的灭菌。 下表列出了常用化学消毒剂及其使用方法。
dN kN d
（6-1）
式中，N——培养基中活的微生物个数 τ——时间(s) k ——比死亡速率(s-1)
dN/dτ——微生物的瞬时变化率，即死亡速率
积分，得
N ln k N0
或
N N 0 e k
（6-2） （6-3）
在一定温度下，不同的微生物有 不同的比死亡速率，κ值越大，表 明微生物较容易死亡。
（5）冷却
喷淋冷却器结构简单，广泛地被用作连续灭菌的冷却设备。
5.3
空气的除菌
自然空气中含有灰尘颗粒、水蒸 汽和各种杂菌。空气中的微生物主要 是细菌、酵母菌、霉菌和病毒，它们 大多附着在空气中的灰尘上。因此， 凡是尘埃浓度高的地区，空气中所含 微生物的量也越多。 空气的除菌是好氧发酵成败的一个重
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告一、实验目的本实验旨在掌握培养基的制备方法和灭菌技术，为后续的微生物培养提供保障。
二、实验原理1. 培养基的制备方法：（1）选用适当的基质：如蛋白胨、肉汤、蔗糖等；（2）添加必需元素：如氮源、碳源、矿物质盐等；（3）调节pH值：使其接近微生物生长最适pH值；（4）加入琼脂：使液态培养基凝固成固态培养基。
2. 灭菌技术：灭菌是指将微生物及其孢子全部杀灭或去除，以保证培养基无菌。
常用的灭菌方法有高温灭菌法和化学药剂灭菌法。
三、实验材料和设备材料：蛋白胨、肉汤、琼脂、氧化钠等。
设备：量筒、天平、自动移液器、恒温水浴器等。
四、实验步骤1. 制备液态培养基：（1）称取所需的蛋白胨和肉汤，按比例混合加入适量的蒸馏水中，搅拌均匀；（2）调节pH值至7.0-7.2，若pH值过高可加入适量的氧化钠溶液；（3）将制好的液态培养基分装到不锈钢培养皿中，每个培养皿约20ml；（4）将分装好的液态培养基在恒温水浴器中加热至沸腾，持续煮沸10分钟。
2. 制备固态培养基：（1）按照液态培养基制备方法制备好液态培养基；（2）将琼脂加入到液态培养基中，搅拌均匀；（3）将制好的固态培养基分装到无菌试管或无菌平板中；（4）在恒温水浴器中加热至琼脂完全溶解。
3. 灭菌：将制备好的液态和固态培养基放入高压灭菌锅中进行灭菌处理，温度和时间根据不同材料和设备而定。
五、实验结果经过灭菌处理后，制备好的液态和固态培养基均无菌，可以用于微生物培养。
六、实验注意事项1. 实验过程中要严格遵守无菌操作规范，以保证培养基无菌。
2. 制备液态培养基时，要注意加入必需元素的比例和pH值的调节。
3. 制备固态培养基时，要注意琼脂的加入量和溶解度。
4. 灭菌处理时，要根据实验材料和设备选择合适的灭菌方法和时间。
5. 实验结束后，要对实验器材进行消毒处理。
七、实验结论本实验通过制备液态和固态培养基以及灭菌处理等操作，掌握了培养基制备和灭菌技术。
第5章 灭菌
5.2.3 连续灭菌的设计
1.连消塔连续灭菌流程
2、喷射加热连续灭菌流程
3、薄板换热器连续灭菌流程
4.连续灭菌设备的结构
套管式连消塔（加热）
蒸汽导入管
外套管
喷嘴式连消塔（加热）
维持罐（保温）
薄板换热器（冷却、加热）
5.3 空气的除菌
氧气 氮气 气态物质的混合物 惰性气体 二氧化碳 水蒸汽 空气（即大气） 空气（即大气） 悬浮在空气中的灰 尘
可穿透玻璃、陶瓷和薄塑料等物质，但不能穿透金属表面。 可穿透玻璃、陶瓷和薄塑料等物质，但不能穿透金属表面。 主要用于食品、非金属器械、检验室用品、无菌室和病室中食品用具、 主要用于食品、非金属器械、检验室用品、无菌室和病室中食品用具、 药杯及其他用品的消毒。 药杯及其他用品的消毒。
5.1.3 干热灭菌
5.2.2 培养基的分批灭菌
1. 分批灭菌的设计 在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过 程包括升温、保温、降温三个过程。
灭菌
2. 保证分批灭菌成功的要素
内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠， 蛇管无穿孔现象； 压力稳定的蒸汽； 合理的操作方法。
发酵罐体积越大， 发酵罐体积越大，培养基 中高温下持续的时间也越 长，其营养成分遭受破坏 也越严重。 也越严重。
干热灭菌的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。 干热灭菌的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。
1. 焚烧 用于废弃物品或动物尸体等； 用于废弃物品或动物尸体等； 2. 烧灼 用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。 用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。 3. 干烤 烤箱灭菌（ ），适用于高温下不变质 烤箱灭菌（160~170ºC，2h），适用于高温下不变质、不损坏、不蒸 ， ），适用于高温下不变质、不损坏、 发的物品 4. 红外线 红外线是一种0.7~1000µm波长的电磁波， 尤以 波长的电磁波，尤以1~10µm波长的热效应 红外线是一种 波长的电磁波 波长的热效应 最强，热效应只能在照射到的表面产生，多用于医疗器械的灭菌。 最强，热效应只能在照射到的表面产生，多用于医疗器械的灭菌。
培养基消毒灭菌的方法
培养基消毒灭菌的方法
培养基消毒灭菌的方法有以下几种：
1. 高压蒸汽灭菌：将培养基装入培养器中，使用高压蒸汽进行灭菌，常见的设备是高压蒸汽灭菌器或压力灭菌锅。
该方法可以有效地杀灭细菌，真菌和病毒，且操作简单方便。
2. 干热灭菌：将培养基放入烘箱中，在高温下进行干热灭菌，常见的设备是干热灭菌器或烘箱。
该方法适用于一些耐热的培养基，能够杀灭大多数微生物。
3. 紫外线辐射灭菌：将培养基暴露于紫外线辐射下，使用紫外线灭菌器进行灭菌。
该方法适用于对热敏感的培养基，但不能灭活孢子。
4. 化学消毒方法：将培养基暴露于适当浓度的消毒剂中，常见的消毒剂包括酒精、漂白粉、过氧化氢等。
不同消毒剂的使用方法和消毒效果略有不同，需要根据具体情况选择合适的消毒剂。
无论使用哪种方法进行消毒灭菌，都需要注意操作的严密性，保证培养基在消毒过程中不受污染。
此外，消毒灭菌后的培养基应密封保存，尽量减少二次污染的可能性。
生物化工工艺学--第5章--培养基的灭菌
应用范围：空气消毒 手术室、传染病房、细菌实验室 不耐热物品的表面消毒
电离辐射
包括高速电子、X射线和 γ 射线 杀菌机理：产生游离基，破坏DNA。
应用范围： 一次性医用塑料制品的消毒
食品的消毒不破坏其营养成分
1.3 过滤除菌法
用物理阻留的方法 将液体或空气中的细菌除去，以达到除菌目的
滤菌器
含有微细小孔<0.22微米，只允许液体或气体通过，而大 于孔径的细菌等颗粒不能通过
方法二： ①求T1和T2时对应的K1和K2值； ②则有：
E ln K1 ln A RT1
两式相减有： ln
K 2 E 1 1 K1 R T1 T2
E ln K 2 ln A RT2
可计算ΔE
小结： ①ΔE一定时，T增加则K值变大；
龙胆紫
3%~5%
浅表创伤消毒
影响灭菌作用的因素
种类
菌龄
试剂
细菌
浓度
种类
作用时间
环境
有机物 温度 酸碱度
选择适当的消毒剂
有效 低毒 低破坏 方便 价廉 易贮藏
各种灭菌方法的特点及适用范围
灭菌方法
火焰灭菌法
原理及条件
火焰杀死微生物
特点
方法简单、灭菌彻底，适 用范围有限
适用范围
接种针、玻璃棒、 试管口、三角瓶口、 接种管 金属或玻璃器皿
适用范围 血清、毒素、抗生素以及空气等的除菌
1.4 低温与干燥
冷冻真空干燥法： 在低温状态下真空抽去水分
用途：保存菌种
二 化学消毒灭菌法
常用消毒剂种类
类别 作用机制
蛋白变性，细胞膜损伤 蛋白凝固 氧化、蛋白沉淀 氧化、蛋白酶变性 氧化、蛋白沉淀 蛋白变性，细胞膜损伤 干扰氧化、抑制繁殖 石炭酸 75%乙醇 高锰酸钾 红汞、硫柳汞 过氧乙酸、碘酒 新洁而灭 龙胆紫
第五章 灭 菌
• 如果以菌残留数的对数与灭菌时间t在半对数坐标 纸上作图，得到的残留曲线为一直线，其斜率为-K
某些微生物的残留曲线
营养细胞的热死表现出典型的对数死亡速率
营养细胞典型死亡速率数据（大肠杆菌）
a.54 ℃
b.56 ℃
c.58 ℃
d.60 ℃
细菌芽孢的热死表现出非对数死亡速率
芽孢典型死亡速率数据（嗜热脂肪芽孢杆菌）
• 空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气的要求，根据 空气的性质制定的。此外，也要从吸气环境的空气条 件和所采用设备的特性综合考虑后设计。 • 对一般要求的低压无菌空气，可直接采用鼓风机增压 后进入过滤器，经过一至二次过滤除菌制得。如无菌 室、超净工作台等的无菌空气就是采用这一简单流程。 一般深层通风发酵，除了要求无菌空气具有必要的无 菌程度外，还需具有一定的压力，这即是比较复杂的 空气除菌流程。
30 min。
• 致死温度是杀灭微生物的极限温度
• 致死时间是在致死温度下杀灭微生物所需时间
• “热死时间”：在规定温度下杀死一定比例的存在的 微生物菌体所需要的持续时间 • 热阻：微生物对热抵抗力，指在某一特定条件下（温 度、加热方式）的致死时间 • 相对热阻是指相同条件下两种微生物的热阻的比值
不影响发酵为限，作为发酵的依据
2. 微生物的热死动力学——对数残留定律
• 在灭菌过程中，微生物由于受到不利环境的
作用，随时间逐渐死亡，其死亡速率（dN/dt）
与任一瞬间残存的菌数成正比
• • • • • • • • •
dN/dt=-KN N：存活的菌体数 个/ml t：灭菌时间 S K：比死亡速率 1/S， dN/dt 代表菌的瞬时变化速率 将上式积分得 lnN0/Nt=Kt t=1/K•lnN0/Nt=2.303/k •lgN0/Nt N0：开始灭菌时原有菌体数 Nt：灭菌结束时残留菌体数
对培养基灭菌的常用方法
对培养基灭菌的常用方法常用的培养基灭菌方法有以下几种：1. 高温灭菌法：将培养基装入培养器中，加热至高温，一般为121摄氏度，保持一定时间，通常为15-20分钟。
高温能够有效灭活细菌、病毒和真菌等微生物，确保培养基的无菌状态。
2. 过滤灭菌法：将培养基通过特制的膜过滤器进行过滤，膜孔径一般为0.22微米或0.45微米。
膜过滤器能够有效阻隔微生物的传播，使培养基中的微生物被滤除，从而实现无菌的目的。
需要注意的是，过滤灭菌法适用于不含热敏性成分的培养基。
3. 化学灭菌法：通过添加化学消毒剂来灭活培养基中的微生物。
常用的消毒剂有酒精、酚类、过氧化氢等。
化学灭菌法适用于无法进行高温灭菌或过滤灭菌的情况下，能够有效地杀灭细菌、病毒和真菌。
4. 辐射灭菌法：利用辐射能对培养基进行灭菌。
常用的辐射灭菌方法有紫外线照射和γ射线照射。
紫外线照射能够破坏微生物的DNA 结构，从而使其失去活性。
γ射线具有较高的穿透力，能够深入杀灭微生物。
辐射灭菌法适用于对热敏性物质进行灭菌。
在进行培养基灭菌时，需要注意以下几点：1. 根据不同的培养基成分和用途选择合适的灭菌方法。
不同的培养基可能对温度、辐射或化学消毒剂有不同的耐受性，因此需要根据实际情况选择合适的灭菌方法。
2. 灭菌前要将培养基装入适当的容器中。
常见的容器有试管、烧杯、培养皿等。
容器必须具备耐高温、耐辐射或耐化学消毒剂的特性，以确保灭菌的有效性。
3. 确保灭菌设备的正常工作状态。
高温灭菌法需要使用高压高温的压力锅或高压灭菌器，因此需要检查设备的压力表、温度计等是否正常工作，以确保灭菌的可靠性。
4. 灭菌后要及时密封容器。
灭菌后的培养基容器应立即密封，以防止外界微生物的污染。
密封后的培养基应存放在干燥、阴凉的地方，以延长其保存期限。
培养基的灭菌是微生物实验中的重要步骤，通过合适的灭菌方法可以确保培养基的无菌状态，为后续的微生物培养和研究提供可靠的基础。
在进行培养基灭菌时，需要选择合适的灭菌方法，并注意操作的细节，以确保灭菌的有效性和培养基的质量。
第五章 植物组织培养中常见问题及解决办法
三、 玻璃化
（一）定义
在组培过程中，叶片和嫩梢 呈透明或半透明水浸状的培养 物称为玻璃苗。
（二）玻璃化苗的特点
1、玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿，叶片皱缩成 纵向卷曲，脆弱易碎。
2、叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔， 仅有海绵组织而无栅栏组织。
3、体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、 纤维素和木质素含量低。
组培中常见问题 及解决办法
一、污染
（一）定义 是指在培养过程中，培养基
或培养材料上滋生细菌、真菌等 微生物，使培养材料不能正常生 长导致培养失败的现象。
（二）常见的菌源 真菌和细菌
1、细菌污染一般在接种1-2天后即
可发现，表现为培养基表面出现黏 液状菌斑。
ห้องสมุดไป่ตู้
2、真菌污染一般在接种3天甚至10天以
二、褐变
（一）定义 在组培过程中，培养材料向培养基中 释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色， 培养材料也随之变褐死亡的现象。
（二）褐化的主要原因
1、品种：由于多酚氧化酶活性上的差异， 有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有 些品种的外植体在接种后不易褐变。 2、生理状态：一般来说，幼嫩的组织在接 种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接 种后褐变程度较为严重。
4、吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降 低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至 死亡。
5、生根困难，移栽成活率低。
（三）防治措施
1、增加培养基中的溶质水平，以降低培养 基的水势； 2、减少培养基中含氮化合物的用量；
3、增加光照；
4、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这 对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
5、降低培养温度，进行变温培养，有助于 减轻试管苗玻璃化的现象发生；
微生物发酵制药技术基础—培养基和设备的灭菌
K1
K `1
ln（ K 2 ） ln（ K`2 ）
K1
K `1
即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要
大于培养基成分破坏速率的增加倍数。
从上述的分析可知，在热灭菌过程中，同时会发生微生 物死亡和培养基破坏这两种过程。温度升高，菌体死亡 速率大于培养基成分破坏的速率。
不同灭菌温度、时间与培养基成分破坏情况（Ns/No=10-3）
缺点： • 设备较庞大； • 维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生
局部过热或灭菌不足的现象； • 喷淋冷却管道很长，对于黏度较高、固形物含量较
多的培养基极易堵塞。
2.喷射加热器加热的连续灭菌流程
优点：能保证培养液在喷射加热器和维持管中的先进 先出，避免了培养基过热和灭菌不彻底现象，培养基 总的受热时间短，营养物质的损失不严重。
依设备和工艺条件的不同，连续灭菌分：
• 连消塔加热的连续灭菌流程 • 喷射加热器加热的连续灭菌流程 • 薄板换热器加热的连续灭菌流程
1.连消塔加热的连续灭菌流程
这是国内味精厂普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连 消塔与蒸汽直接混合，在连消塔内的停留时间为20～30s，达 到灭菌温度132℃。再送入维持罐保温，时间8～25min，最后 由喷淋冷却器冷却至后续的发酵或培养温度。
连续灭菌的优缺点
优点 • 短时间内加热到保温温度且能快速冷却，减少养分的损失 • 操作条件恒定，灭菌质量稳定 • 易于实行管道化和自动化控制 • 避免反复加热和冷却，提高了热利用率 • 发酵设备利用率高
缺点 • 设备要求高，需另外设置加热冷却装置 • 操作比较麻烦 • 染菌机会多 • 对蒸汽要求高 • 不适合大量固体物料的灭菌
（二）对数残留定律
第5章-灭菌及空气除菌解析
用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求: 既要达到一定的灭菌程度。 又要尽量减少营养成分的破坏。
（一）理论灭菌时间
某些分子的分解和分子内部的重新排列 的反应属于单分子反应。
杂菌虽然是一个复杂的高分子体系, 但 其受热被杀死, 主要原因是高温能使蛋 白质变性, 这种反应属于单分子反应, 因此, 杂菌在一定温度下受热死亡也遵 循单分子反应方程。
影响加压蒸汽灭菌效果的因素
（1）灭菌物体含菌量的影响 （2）灭菌锅内空气排除程度的影响 （3）灭菌对象pH的影响 （4）灭菌对象的体积 （5）加热与散热速度
（1）灭菌物体含菌量的影响
天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成 的培养基, 一般含菌量较高, 而用纯粹 化学试剂配制成的组合培养基, 含菌量 低。
作分别灭菌, 然后再混合, 就不易形成磷酸 盐沉淀。
（4）对含有在高温下易破坏成分的培养 基（如含糖组合培养基）可进行低压灭 菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸 2下灭菌15min）或间歇灭菌。
（5）在大规模发酵工业中, 可采用连续 加压灭菌法进行培养基的灭菌。
（四）灭菌设备
1. 高压蒸汽灭菌设备 2. 常压蒸汽灭菌锅
二、几个概念
（一）灭菌 （二）消毒 （三）防腐 （四）化疗
（一）灭菌（sterilization）
灭菌: （p128） 采用理化因素使任何物体内外部的一切微生
物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭 菌。 Sterilization就是失去繁殖力。
例如各种高温灭菌措施等。 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌
体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后， 其细胞发生溶化、消失的现象 。
（二）消毒
从字义上来看, 消毒就是消除毒害, 这 里的“毒害”就是指传染源或致病菌的 意思。
培养基灭菌方法
培养基灭菌方法1. 简介培养基灭菌是微生物实验室中的一个重要步骤，用以防止细菌、真菌和其他微生物的污染。
只有确保培养基的无菌，才能保证实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍一种常用的培养基灭菌方法。
2. 材料与设备•培养基（含有养分或选择素）•灭菌用的容器（如培养皿、试管等）•培养基灭菌设备（如高压灭菌器、电子灭菌器等）•经验证的灭菌指示器（如生物指示器、化学指示器等）•镊子、手套、口罩等个人防护装备3. 实施步骤步骤1：准备工作•工作台面以及实验室环境清洁整齐，并进行必要的消毒。
•检查培养基的质量和保存条件，确保其符合使用要求。
•检查培养基灭菌设备的状态，确保该设备能正常使用。
步骤2：准备培养基•根据实验需要，准备相应的培养基，并确保其完整无损。
•根据培养基的用途需求，可添加特定的选择素或抗生素。
步骤3：装填培养基•使用灭菌镊子将适量的培养基取出，并装入预先准备好的灭菌容器中。
•目标是在容器表面上薄薄地均匀铺开培养基，并确保不形成空气泡。
步骤4：选择合适的灭菌方法•根据培养基的性质和要求，选择合适的灭菌方法：–高压灭菌：用于固体和液体培养基的灭菌。
–电子灭菌：用于灭菌液体培养基等特定情况。
–等离子体灭菌：用于特殊要求的灭菌。
•在灭菌之前，应确保灭菌设备已经预热并达到适当温度。
步骤5：灭菌操作•将装有培养基的容器放入灭菌设备中。
•根据设备的操作说明，设定合适的灭菌参数（如时间、温度、压力等）。
•启动灭菌设备开始灭菌过程。
步骤6：灭菌后处理•等待灭菌过程完成后，关闭灭菌设备。
•使用经验证的灭菌指示器，如生物指示器或化学指示器，检查灭菌效果是否合格。
•将灭菌好的培养基搬移到无菌的工作区域，可用于后续实验操作。
4. 安全注意事项•使用培养基灭菌设备时，要注意遵守相关安全操作规程，佩戴好个人防护装备，如手套、口罩等。
•在灭菌过程中，注意灭菌设备的温度和压力，以防止设备故障或操作错误导致的意外事故。
•在操作过程中要注意无菌操作，避免外界的颗粒物和细菌污染。
第6章 培养基的灭菌
第二节 湿热灭菌的理论基础
lnK
ln k ln Ae ln k
`
E RT E RT
`
ln Ae
E ln k ln A RT E ` ln k ln A RT
`
1/T
第二节 湿热灭菌的理论基础
灭菌时温度从T1
E RT E RT
`
T2时：
k2 E 1 1 ln ( ) k1 R T1 T2 k ln k 相除
培养基灭菌的要求和方法
在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长
得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；
杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难
杂菌会降解目的产物； 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品； 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。
第二节 湿热灭菌的理论基础
培养基湿热灭菌需解决的工程问题
• 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N
（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。 • 灭菌温度和时间的确定取决于：
– 杂菌孢子的热灭死动力学 – 反应器的形式和操作方式
– 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
第二节 湿热灭菌的理论基础
相对热阻 1.0 3×106 2~10 1~5
主要灭菌方法
• 培养基成分对灭菌的影响
– 油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物 的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色 素等可削弱其耐热性。
• 培养基的物理状态对灭菌的影响 • 培养基中微生物数量对灭菌的影响 • 培养基中氢离子浓度对灭菌的影响
– 培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培 养基的 酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越 低。
第五章灭菌——精选推荐
第五章灭菌第五章灭菌污染杂菌的危害1.消耗营养物质。
2.抑制发酵菌⽣长。
3.改变培养液理化性质。
4.抑制产物⽣物合成。
5.噬菌体污染。
第⼀节灭菌的基本原理⼀、灭菌定义指⽤化学的或物理学的⽅法杀灭或除掉物料或设备中所有的有⽣命的有机体的技术或⼯艺过程。
⼆、常⽤灭菌⽅法1.化学物质灭菌利⽤化学试剂（甲醛、苯酚、⾼锰酸钾等）与微⽣物细胞中某种化学成分反应，如使蛋⽩质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等杀灭微⽣物。
应⽤：实验室和⽆菌室的空间灭菌，设备、器械、双⼿的消毒灭菌，但不能⽤于培养基的灭菌。
2.辐射灭菌原理：利⽤⾼能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微⽣物常⽤：紫外线、X 射线和γ射线紫外线：诱导了胸腺嘧啶⼆聚体的形成和DNA 链的交联，从⽽抑制了DNA 的复制，导致菌体死亡。
波长为260nm 的杀菌⼒最强穿透⼒差。
应⽤：适于表⾯灭菌。
⽆菌室、接种箱3.⼲热灭菌在⼲燥⾼温条件下，微⽣物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，是微⽣物的致死率迅速增⾼的过程。
常⽤⽅法：灼烧和电热箱加热，160℃ 2⼩时发酵的流程空⽓空⽓净化处理保藏菌种斜⾯活化扩⼤培养主发酵碳源、氮源、⽆机盐等营养物质灭菌成品使⽤范围：需要保持⼲燥的器械、容器的灭菌。
玻璃及⾦属⽤具及沙⼟管灭菌4.过滤除菌原理：利⽤微⽣物不能透过滤膜⽽达到除菌⽬的。
⽅法: 0.01~0.45 m孔径滤膜，使⽤范围：⽤于压缩空⽓、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。
5.湿热灭菌由于蒸汽具有很强的穿透⼒，冷凝时可释放出⼤量潜热，且在⾼温有⽔分条件下，蛋⽩质易变性，使微⽣物死亡。
常⽤⽅法：⽔煮常压灭菌：100℃，40-60min⾼压蒸汽灭菌：⼀般121℃，30分钟使⽤范围：培养基和发酵设备灭菌。
湿热灭菌的优点：蒸汽有强的穿透⼒，灭菌易于彻底；蒸汽来源容易，操作费⽤低，本⾝⽆毒；操作⽅便，易管理。
三、湿热灭菌的理论基础1.灭菌指标的确定⼤多数微⽣物最适温度为25~27℃,维持温度为5~50℃，当温度超过最⾼限温时微⽣物就会发⽣死亡。
培养基灭菌的目的和要求课件
PART 02
培养基灭菌的方法
高压பைடு நூலகம்汽灭菌法
高效、广泛应用 注意事项
高压蒸汽灭菌法是一种常用的培养基灭菌方法， 利用高温高压蒸汽杀灭培养基中的微生物。由于 其高效、操作简便且灭菌效果可靠，被广泛应用 于实验室和工业生产中。
使用高压蒸汽灭菌法时，需注意温度和压力的控 制，以确保达到最佳的灭菌效果。同时，要确保 培养基的密封性，以防蒸汽进入培养基中影响其 成分。
过滤除菌法
01
适用于液体培养基
02
03
过滤除菌法是通过过滤介质 去除培养基中的微生物，适 用于液体培养基的灭菌。过 滤介质能够阻挡微生物通过， 从而达到除菌目的。
注意事项
04
过滤除菌法的关键在于选择 合适的过滤介质和确保过滤 前的培养基充分混匀，以保 证过滤效果。此外，对于一 些较大颗粒的物质，可能需 要预处理以避免堵塞过滤器。
灭菌压力的要求
压力控制
灭菌压力必须达到规定的要求， 以确保微生物的完全杀灭。不同 的灭菌方法所需的压力不同，常 见的灭菌压力范围在1-2个大气
压之间。
压力均匀性
在灭菌过程中，培养基内的压力 必须均匀，以避免部分微生物逃
脱灭菌过程。
压力稳定性
灭菌压力应保持稳定，以避免因 压力波动而影响灭菌效果。
PART 04
应定期更换灭菌设备的配件，如密封圈、过滤器等，以确保其正常 运转和灭菌效果。
THANKS
感谢观看
避免过度加热
过度加热会导致培养基成分发生变化，影响其质 量和实验效果。
避免干燥
在灭菌过程中，应保持培养基湿润，避免干燥， 以免影响其质量和实验效果。
注意对灭菌设备的维护和保养
定期检查
培养基常用的灭菌方法
培养基常用的灭菌方法培养基是适于细菌生长繁殖需要的各种营养物质人工配制而成的基质。
按营养成分和用途不同，分为基础、合成、营养、鉴别、选择和厌氧培养基。
按物理形态分为固体、半固体和液体三类。
根据细菌的种类和培养目的不同，可采用不同的培养基。
1、灭菌方法培养基的灭菌方法主要有两种，湿热灭菌及0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
与过滤相比，高压蒸汽灭菌的工作强度小，成本较低但易造成营养成分的流失，而且在多次加样（无菌谷氨酰胺溶液，无菌碳酸氢钠溶液等）过程中容易造成二次污染。
大多数培养基采用0.1～0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤除菌，并且已成为培养基除菌的发展方向，它可低限度地减少培养基的营养损失。
1.1 湿热灭菌蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，并且蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键使酶失活，微生物因代谢障碍而死亡。
湿热灭菌的效果取决于致死温度和致死时间。
致死温度是杀灭微生物的极限温度。
致死时间是在致死温度下杀灭全部微生物所需时间。
高压蒸汽灭菌适合于耐高温培养基、接种器械和蒸馏水的灭菌。
灭菌时一般是在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。
为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证很关键。
1.2 过滤灭菌可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为聚醚砜（PES）膜、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、聚四氟乙烯（PTFE）膜、醋酸纤维素、硝酸纤维素等等。
一般采用正压过滤，正压过滤较之负压过滤具有高流速、过滤快、不易污染，可避免蛋白质产生大量气泡等优点。
目前大多数实验室和制药企业采用微孔滤膜、一体式过滤器（囊式过滤器）或筒式滤芯除菌。
微孔滤膜需配套不锈钢夹具，中间可夹放0.22um滤膜。
使用这种滤器最重要步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
筒式滤芯亦需配套不锈钢滤壳。
如果是少量过滤(<200ml)可选配针头过滤器。
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参见：《微生物工程工艺原理》P226、伦世仪主编《生化工程》P13。
3，保证间歇灭菌成功的要素
（1）内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象
（2）压力稳定的蒸汽
（3）合理的操作方法。
发酵罐的接管图
或
实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120?C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。
三、温度对K的影响
微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征
优点
-设备投资较少
-染菌的危险性较小
-人工操作较方便
-对培养基中固体物质含量较多时更为适宜
缺点
-灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。
五、影响灭菌的因素
（1）培养基成分对灭菌的影响
油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。
7，湿热灭菌中的相关定义
? 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。
? 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。
（2）反应器的形式和操作方式
（3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
二、微生物的热死灭动力学方程
实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：
N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）
t：时间（min）
K：比热死速率常数（min-1）
取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得 Leabharlann 连消器 喷射加热器
薄板换热器
维持罐
（2）连消塔计算（自学）
参见《发酵工程与设备》P53
四、连续灭菌与间歇灭菌的比较
受热物质 ΔE（J/mol） 维生素B12
维生素B1盐酸盐
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子
肉毒梭菌孢子
枯草杆菌孢子 96232
92048
283257
343088
317984 如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的ΔEBS =67000× 4.184（J/mol），维生素B1的ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol），
孢子热死亡的规律符合
积分得（8）
在分批灭菌过程中
因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不是常数，所以：
式中Kh是保温阶段的孢子比热死亡速度常数
分批灭菌中几种换热方式的温度-时间变化关系
T：介质温度（K）；T0：介质初温（K）；t：时间（min）；h：蒸汽相对于介质的热焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min）；M：介质重量(kg)；Cp：介质比热[kJ/(kg.K)]； TH：热源温度(K)；U：总传热系数[kJ/（m2.min.K）]；q：传热速率（kJ/min）；C'p：冷却剂比热；W：冷却剂流率；TCO：冷却剂温度
4，培养基间歇灭菌过程中应注意的问题
（1）温度和压力的关系
（2）泡沫问题
（3）投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题
（4）灭菌结束后应立即引入无菌空气保压
三、连续灭菌的设计
1，连续灭菌的流程
（1）喷射加热连续灭菌
喷射加热连续灭菌流程
（2）培养基的物理状态对灭菌的影响
（3）培养基中微生物数量对灭菌的影响
（4）培养基中氢离子浓度对灭菌的影响
培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的 酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。
（5）微生物细胞中水分对灭菌的影响
细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底
（6）微生物细胞菌龄对灭菌的影响
? 蒸汽有很大的潜热；
? 操作方便，易管理。
第二节 湿热灭菌的理论基础
一，培养基湿热灭菌需解决的工程问题
1，将培养基中的杂菌总数N0 杀灭到可以接受的总数N（10-3）， 需要多高的温度、多长的时间为合理。
2， 菌温度和时间的确定取决于：
（1）杂菌孢子的热灭死动力学
典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图
（2）薄板换热器连续灭菌
薄板换热器连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图
（3）喷淋冷却连续灭菌
喷淋冷却连续灭菌流程
2，连续灭菌设计及计算举例（自学）
将灭菌温度从105?C提高到127?C，KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min-1），KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min-1）。
老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高
（7）空气排除情况对灭菌的影响
（8）搅拌对灭菌的影响
（9）泡沫对灭菌的影响
六、发酵罐的灭菌
培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从徘气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。
2，灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。
二、培养基灭菌的目的
1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：
生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；
（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；
（5）使用无污染的纯粹种子。
3，培养基灭菌的目的
杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。
4，培养基灭菌的要求
（1）达到要求的无菌程度（10-3）
（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用
过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。
各种微生物对湿热的相对热阻
微生物 相对热阻 营养细胞和酵
母
细菌芽孢
霉菌孢子
病毒和噬菌体 1.0
3×106
2~10
1~5
8，湿热灭菌的优点
? 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；
? 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；
1，连续灭菌的优缺点
优点
-保留较多的营养质量
-容易放大
-较易自动控制；
-糖受蒸汽的影响较少；
-缩短灭菌周期；
-在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；
-发酵罐利用率高；
-蒸汽负荷均匀。
缺点
-设备比较复杂，投资较大。
2，分批灭菌的优缺点
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响
灭菌温度（?C） 达到灭菌程度的时间（min） 维生素B1的损失（%） 100
110
120
130
140
150 843
75
7.6
0.851
参见：《微生物工程工艺原理》P228，
伦世仪主编《生化工程》P22。
3，连续灭菌设备的结构及计算
（1）设备结构：
套管式连消塔
喷嘴式连消塔
第五章 培养基及设备的灭菌
第一节 培养基灭菌的目的、要求和方法
一、定义
1，培养基灭菌的定义
是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。
杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难
杂菌会降解目的产物；
杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。
2，工业上具体措施包括：
（1）使用的培养基和设备须经灭菌；
（2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；
（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；
K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有关，对方程（5）两边对T取导数，得方程（6）。
由方程（6）可得出结论：反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大
试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某些有效成分热破坏反应的ΔE较低（见下表）。将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少。
0.107
0.015 99.99
89
27
10
3
1
第三节 培养基灭菌的工程设计
一、无菌的标准
根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3。