PCR-DGGE技术
土壤学中的土壤微生物群落分析方法
土壤学中的土壤微生物群落分析方法土壤生态系统是一种充满生机的生物体系，其中土壤微生物群落是其中最丰富和重要的组成部分之一。
土壤微生物在土壤生态系统中起着重要的作用，包括有机质分解、氮循环、生物固氮以及供给植物生长所需的营养元素等。
因此，对土壤微生物群落进行准确分析有助于了解土壤生态系统的健康和状况，为环境保护和农业生产提供有价值的参考依据。
本文将介绍土壤学中常用的土壤微生物群落分析方法。
一、DNA测序技术近年来，随着高通量测序技术的不断发展和成熟，DNA测序技术已成为研究土壤微生物群落多样性的主要手段。
目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和PacBio测序等。
这些技术的主要区别在于读长、测序准确度、数据处理复杂度和成本等方面。
其中，Illumina测序技术是应用最广泛的测序技术之一。
该技术具有高通量、高准确度和低成本等优势，能够产生数百万到数十亿个序列，适用于研究微生物群落组成、特定功能基因的分布和微生物群落的分子进化等。
但该技术也存在一些限制，如读长短、测序偏差和寡核苷酸错误等，需要进行数据过滤和样本对比等后续分析。
二、FISH技术FISH（Fluorescence In Situ Hybridzation）是一种在原位的方法，能够直接观测微生物群落中细菌的存在和数量。
该技术使用DNA探针标记靶细胞的核酸序列，配合荧光探针进行检测和成像，可以定量测量目标细菌在样品中的丰度和空间分布。
FISH技术的优势在于高分辨率的成像和定量准确性，能够提示具体的微生物存在形态，如球形、杆状等。
三、PCR-DGGE技术PCR-DGGE（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）技术依赖PCR扩增样品中的16S rRNA基因，然后将PCR产物在含有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过电泳道中的变性梯度来分离不同的微生物群落。
微生物生态学研究中的分子生物学方法
微生物生态学研究中的分子生物学方法微生物是地球上最为丰富、多样且广泛分布的生物，有着重要的生态功能。
在微生物生态学研究中，许多问题需要考虑微生物的多样性、生态学分布及其作用和适应性。
传统的微生物学研究通常依赖于纯培养和形态学特征进行分类和鉴定，但存在着很大的缺陷，许多微生物无法进行纯培养，而且在分布及功能上存在巨大的多样性和复杂性。
因此，利用分子生物学方法，在微生物生态学研究中推进更为深入的探索和解决问题尤为重要。
分子生物学方法已经成为微生物学研究中的常规手段。
其中，分子生态学作为微生物生态学研究的一个重要分支，是利用微生物群落的DNA序列来描述微生物的多样性和结构、分布模式、演化规律以及生态功能。
分子生态学是利用分子生物学技术，以微生物群落DNA为物质基础，分析微生物群落的结构及其变化和生态功能的研究领域。
常见的分子生态学方法有PCR-DGGE、PCR-SSCP、PCR-RFLP 等。
PCR-DGGE技术是一种评价微生物群落构成的分子生物学方法，也是分子生态学研究中最常采用的一种方法。
此技术通过扩增轮廓分析电泳，能够在不进行序列测定的情况下，迅速知道样品中微生物群落的构成情况。
DGGE是一种革命性的电泳技术，可以使得同样长度、不同序列的DNA分子发生不同程度的变性而达到不同的电泳迁移率，因此，能够从PCR扩增产物中分离出不同种群、不同数量的DNA序列，可用于分析种群的构成和动态变化。
PCR-SSCP技术是用来研究微生物群落中小亚基的分子生物学方法。
它可以通过分析不同峰的数量及大小，评估群落的多样性和结构。
其原理是在一定条件下，所有长度相同的PCR产物的突变体将由于核酸热变性、缺陷组态和电泳带电性质等不同而形成不同的电泳迁移率，从而显示在聚丙烯酰胺凝胶上。
PCR-RFLP技术是将PCR扩增的外显子或内含子序列用限制酶切法切开后，根据限制酶切后DNA片段的数目、大小、分布等特征，依据电泳迁移率或其他方式进行分离鉴定。
DGGE操作步骤
DGGE操作步骤DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）是一种常用的DNA分析技术，用于研究DNA序列的变异情况和分类等。
DGGE的操作步骤如下：1.准备样品2.PCR扩增将待测DNA进行PCR扩增，以增加DNA的数量。
需要用到一对引物，它们会扩增出感兴趣的DNA片段。
PCR反应体系中含有模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液。
引物的选择需要根据研究的目的确定。
3.准备DGGE凝胶将一定比例的聚丙烯酰胺和甲酰胺溶液以一定的比例混合，制备得到DGGE凝胶。
这个比例可以根据需要调整，以获得所需的DNA分离效果。
其中甲酰胺会使凝胶变性，使DNA分子在电泳中以变性形式进行分离。
4.准备DGGE系统将DGGE凝胶置于DGGE装置中。
根据实验需要，在凝胶两端插入电极，接通电源。
将凝胶槽填满电泳缓冲液，用于维持凝胶均匀膨胀，快速散发产热，以及降低电阻。
一般来说，TAE或TBE缓冲液可用于DGGE。
5.准备DNA样品将PCR扩增得到的DNA样品处理成等浓度。
可以用醋酸抽提、酚-氯仿法或商业DNA提取试剂盒等方法进行纯化。
6.电泳分离将等量的DNA样品加入到DGGE样品孔中。
将样品孔上方和下方的空孔填满DNA负载缓冲液，以避免样品在电泳过程中干涸。
开始电泳，一般电泳时间和电场强度要根据平台的规格表决定。
7.停止电泳和染色当DNA样品从顶端到底端通过凝胶后，在适当的时间内停止电泳。
将凝胶取出，根据需要进行染色。
GelRed或者SYBR Green等染料可以用于可视化DNA条带。
8.分析使用相应的软件如Quantity One或ImageJ等，对电泳结果进行分析。
将得到的DGGE电泳图像转化成数值形式，以研究样品中的DNA序列变异情况。
总结：DGGE是一种用于分析DNA序列变异的常用技术。
通过PCR扩增得到的DNA样品，经过一系列处理后，加入到DGGE凝胶中进行电泳分离。
PCR-DGGE实验
2 实验流程1.提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验2.用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验3.DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化4.用不带GC发夹的引物进行PCR5.连接转化，需要用到感受态细胞6.菌落PCR进行验证2.1 DNA提取用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。
2.2 琼脂糖凝胶电泳将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3µL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。
将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm 电压下电泳30min。
在紫外光下观察电泳条带。
2.3 PCR反应及产物纯化采用25µL的反应体系：PCR反应体系成分终浓度引物GC Clamp-F 0.2 μM引物R 0.2 μMM g2+(M g Cl2) 0.5 mMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 U10×Taq Buffer 1×dNTP Mixture 0.2 mMDNA模板1~2μldH2O To 25 μl反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45秒，65 ℃复性45秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；72 ℃最终延伸5min。
将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。
并用紫外分光光度计测定DNA浓度。
2.4 DGGE2.4.1 药品配制：1）40%聚丙烯酰胺丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07g dH2O To 100ml 2）0%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15ml 20ml 25ml 30ml50×TAE缓冲液2ml 2ml 2ml 2ml dH2O 83ml(to 100) 78ml 73ml 68ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。
(完整)PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变 .Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷.不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分.DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链.当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样.然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度,因此它们会在胶中不同的位置分开.然而，一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子,此时他们又能在胶中继续迁移.因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
PCR-DGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
PCR-DGGE技术
究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝 胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁 移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂 梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性 剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部 分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性， 因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标 记方法。
DGGE图谱的聚类分析、相似性分析：DGGE 胶通过扫描仪输
入计算机,通过Molecular Analysis软件进行相似性分析。通过DGGE 后得到的指纹图谱,每一个条带代表某个微生物优势菌群,通过测序和 序列比对,可以得出此优势菌群的种类。
DGGE图谱的主成分分析
DGGE图谱的数字化——Quantity one
3 DGGE分析
（2）电泳
上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。 PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入 缓冲液。
上样时上样器要深入胶孔底部。
尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有marker lane。 将胶放入电泳槽中时注意正负极。 建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。
多样性指数的计算
用Quantity One（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行 数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（ShannonWiener index）
其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度 （height of the peak）占该泳道总灰度的比例。 菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=ln S
PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中的应用
PCR―DGGE法在水体微生物多样性研究中的应用PCR-DGGE法（Polymerase Chain Reaction-Denaturing GradientGel Electrophoresis）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于微生物多样性研究中。
该方法结合了PCR和DGGE两种技术，能够高效地研究水体中微生物的多样性。
在水体环境中，微生物多样性的研究对于了解水体生态系统的结构、功能和风险评估具有重要意义。
传统的经营学方法主要依靠培养方法，存在着无法培养、无法鉴定、样本处理繁琐等问题。
而PCR-DGGE法能够通过直接分析环境中的微生物DNA来研究微生物多样性，具有不依赖培养方法、快速高效、准确性强等优点，成为研究水体微生物多样性的重要工具。
PCR-DGGE法的基本思路是通过PCR扩增目标基因片段，然后将扩增产物在含有梯度浓度的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。
梯度浓度可以是通过改变聚丙烯酰胺中脱氧核糖核酸（DNA）链脱离温度（解聚形成的PCR产物）或通过改变变性剂（封闭螺旋形成缺失DNA链）而形成的。
由于序列不同的DNA分子在不同的电泳条件下迁移速度不同，所以可以通过分析DGGE图谱来了解样品中微生物群落的组成和多样性。
PCR-DGGE法广泛应用于水体微生物多样性研究中。
一方面，该方法能够直接检测水体中的微生物DNA，避免了无法培养的问题，使研究更加准确和全面。
另一方面，PCR-DGGE法具有高通量分析能力，可以同时研究多个样品，提高研究效率。
此外，PCR-DGGE法还可以通过改变PCR反应中的引物和扩增条件，选择不同的目标基因片段，从而研究不同层次的微生物多样性，如细菌、真菌等。
在具体应用中，PCR-DGGE法可以用于研究水体中微生物群落的空间和时间分布。
通过采集不同地点或不同时期的水样，提取DNA并进行PCR-DGGE分析，可以了解不同环境条件下微生物多样性的差异。
例如，可以研究不同水深、不同温度、不同盐度等因素对微生物群落结构的影响。
PCR-DGGE对六种淡水鱼类肠道菌群结构的比较研究的开题报告
PCR-DGGE对六种淡水鱼类肠道菌群结构的比较研究的开题报告一、问题背景和研究意义淡水鱼类是我国水产养殖中的主要品种之一，其肠道菌群对鱼类的健康和生长发育起着重要作用。
鱼类在生长过程中会摄入不同类型的微生物，这些微生物在鱼类肠道中生长繁殖并对鱼类的代谢、免疫系统和生理功能发挥着关键作用。
因此，研究肠道微生物群落结构对于淡水鱼类的健康管理、营养需求和生物安全控制等方面都具有重要的意义。
传统的微生物学方法往往只能在单个约化培养基中检测少数菌株，这限制了肠道菌群复杂性的研究。
PCR-DGGE（聚合酶链式反应 - 变性梯度凝胶电泳）是一种非常常用和有效的分子生物学技术，可以快速和直接地比较不同微生物物种在肠道中的相对丰度。
因此，本研究旨在使用PCR-DGGE技术研究六种淡水鱼类的肠道微生物群落结构，分析不同鱼类的菌群多样性和群落相似性，以期为淡水鱼类的健康管理提供有价值的基础研究。
二、研究内容和方法1. 研究内容（1）采集鱼体样本本研究采集了六种淡水鱼类的肠道样本，包括草鱼、鲢鱼、鲤鱼、青鱼、黑鱼和鲶鱼等常见养殖鱼种。
（2）DNA提取采用常规的菌落PCR技术从肠道中提取总DNA。
（3）PCR-DGGE分析通过16S rRNA基因来检查鱼类肠道中的总细菌群落结构，并使用PCR-DGGE技术来比较鱼类的肠道微生物群落。
（4）数据分析通过聚类分析和多样性指数来比较不同鱼类的肠道微生物群落多样性和群落相似性。
2. 研究方法（1）样本采集收集六种淡水鱼类的肠道样本，将样本置于冰上，随后迅速用无菌手术刀割开腹腔，取出肠道内容物，将其放入1.5mL离心管中。
（2）DNA提取通过基本菌落PCR技术提取肠道样本的DNA。
（3）PCR-DGGE分析使用聚合酶链式反应研究每个样本的16S rRNA，然后通过变性梯度凝胶电泳技术分析PCR反应产物，以比较多个样本之间的菌群差异。
（4）数据分析使用聚类分析和多样性指数比较样本的差异。
变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)
变性梯度凝胶电泳（DGGE）: 一种分离相似大小DNA片段 的电泳方法。即双链DNA在变性剂(如尿素和甲酰胺)浓度或 温度梯度增高的凝胶中电泳，随变性剂浓度升高，由于Tm 值不同，DNA的某些区域解链，降低其电泳泳动性，导致 迁移率下降，从而达到分离不同片段的目的。
由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16sRNA基因序 列中可变区的碱基顺序有很大的差异，其中不同土壤微生 物的16sRNA基因的V3区扩增的DNA片断在DGGE中的应用最为 广泛，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出 样品中微生物的种类多少，粗略分析土壤样品中微生物的 多样性。
In a denaturing gradient acrylamide gel, doublestranded DNA is subjected to an increasing denaturant environment and will melt in discrete segments called "melting domains". The melting temperature (Tm) of these domains is sequencespecific. When the Tm of the lowest melting domain is reached, the DNA will become partially melted, creating branched molecules. Partial melting of the DNA reduces its mobility in a polyacrylamide gel.
The methods of detecting single base mutat ions
DGGE技术及其在微生物研究中的应用
变性梯度凝胶电泳--DGGE摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术具有精确、快速、易操作等特点, 能克服传统微生物研究方法的不足，作为一种分析微生物群落的有效工具被广泛的应用于现代微生物研究。
本文介绍了DGGE技术的原理、操作步骤及应用情况，并讨论了其缺点及应用前景。
关键词：DGGE 分子生物学微生物群落菌群分析1 引言变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是由Fischer 和Lerman[1]于1979 年首先提出了, 并将其用于医学上基因点突变的检测。
与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比, 这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。
1985年, Myers RM[2]等人首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术, 使该技术日臻完善。
1993年，Muyzers[3]等人首先将PCR技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验rRNA的基因,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。
此后的十几年内DGGE技术在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具, 并被广泛用于活性污泥、池塘底泥、污染土壤、海洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道中的微生物多样性检测和种群演替的研究。
2 基本原理PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。
梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯酰胺凝胶中添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。
电泳时，DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。
当DNA双链完全分开时，其电泳速率急速下降。
由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。
PCR-DGGE操作流程
PCR-DGGE操作流程变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE）和FISH一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。
DGGE实验的大体操作流程如下，比较麻烦，影响因素很多，有一段时间我曾经天天捣鼓PCR-DGGE，反复优化各个条件，非常无聊。
1. PCR扩增与普通PCR不同之处是Primer上要加一个GC夹（GC Clamp)，GC夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC常用的细菌16S通用引物341fGC/518r的序列如下：341fGC:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′2.制作凝胶需要的准备的试剂：(1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS） 0.1g in 1ml H2O(2)四甲基乙二胺(TEMED)(3)0%和100%变性剂（100%的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见最下面的表格准备四种不同浓度的凝胶：顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液如果DGGE需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml：40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液如需其它梯度，请重新计算。
PCR-DGGE操作流程
PCR-DGGE操作流程变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE）和FISH一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。
DGGE实验的大体操作流程如下，比较麻烦，影响因素很多，有一段时间我曾经天天捣鼓PCR-DGGE，反复优化各个条件，非常无聊。
1. PCR扩增与普通PCR不同之处是Primer上要加一个GC夹（GC Clamp)，GC夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC常用的细菌16S通用引物341fGC/518r的序列如下：341fGC:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′2.制作凝胶需要的准备的试剂：(1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS） 0.1g in 1ml H2O(2)四甲基乙二胺(TEMED)(3)0%和100%变性剂（100%的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见最下面的表格准备四种不同浓度的凝胶：顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液如果DGGE需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml：40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液如需其它梯度，请重新计算。
PCRDGGE技术
PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。
后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。
该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。
一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。
一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。
当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。
部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧下降。
因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。
PCR-DGGE操作步骤
16S rDNA - DGGE技术基本路线一样品总DNA的提取1 实验器材： 1.5mL离心管，螺口管，锆珠，搅拌器，4℃离心机。
2 实验试剂：PBS（0.05M, pH=7），水饱和酚，TE饱和酚，TNI50，TE缓冲液，TAE缓冲液，NaAc（pH=5.2），氯仿/异戊醇（24：1）（v/v），96%冷乙醇，70%冷乙醇。
3 实验操作：3.1 细胞的分解称取食糜0.3-0.5g，入含0.3g锆珠的离心管中，加1mL TN150溶解然后加入150μL酸性酚，bead-beater 5000rpm，匀浆180秒，冰上冷却加入150μL氯仿/异戊醇（24/1），vortex几秒，10000rpm离心5min，上清转移至eppendorf管。
3.2 DNA提取加入150 µL氯仿/异戊醇至eppendorf管加入150 µL TE饱和酚，涡旋混匀1 min10000 rpm离心，1 min重复上述步骤直至界面清晰为止加入300 µL氯仿/异戊醇，10000 rpm离心1 min取上清液至另一eppendorf管，加96%冷乙醇1mL加入50 µL3M NaAc（pH=5.2）-20℃沉淀DNA过夜10000 rpm离心20 min去除上清液，加入500 µL 70%冷乙醇溶解沉淀10000 rpm离心5 min去除上清液，风干沉淀加入50µL TE缓冲液溶解DNA-20℃保存提取的DNA4实验注意事项：酚是致癌物质，实验操作应配带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。
实验中使用了挥发性有毒物质，操作应在通风橱中进行。
实验过程中样品应放置冰面上，所有离心操作在4℃下进行。
二DNA的检测—琼脂糖凝胶电泳试剂和器材：电泳缓冲液（1*TAE），溴乙锭（EB）染色贮存液（1 mg/mL），0.25%溴酚兰，琼脂糖，双蒸水。
电泳仪，水平电泳槽，透射紫外灯，胶带纸。
PCR-DGGE实验原理和操作步骤
PCR-DGGE实验原理和操作步骤【实验目的】1．了解PCR-DGGE技术的原理。
2．了解并熟悉PCR-DGGE技术的步骤。
【实验原理】变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。
核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。
核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。
Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。
DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。
当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。
这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。
Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。
因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。
为了提高 DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。
GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。
因此，DG GE的突变检出率可提高到接近于100%。
作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。
DGGE的突变检出率为99%以上。
（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。
（3）非同位素性。
DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。
（4）操作简便、快速。
DGGE一般在24小时内即可获得结果。
（5）重复性好。
但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。
【实验用品】1．PCR扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；电泳仪；电泳槽。
2．尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。
PCR-DGGE
DGGE
•Denaturing Gradient Gel Electrophoresis （DGGE）即 变性梯度凝胶电泳，最初是Lerman 等人于20世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的 点突变。 •Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结 构研究。 •目前，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的 各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的 主要分子生物学方法之一。
6、检测PCR和克隆过程中的偏差
Thank You
DGGE
DGGE操作流程
DGGE
制胶
点样
电泳
成像分析
显色
DGGE system (D-Code, Bio-Rad)
DGGE
制胶
DGGE
DGGE
DGGE
点样
DGGE
电泳
DGGE
显色
染色剂： 溴化乙啶(EB) 银 SYBR Green SYBR Gold
凝
使用对象：长度相同但序列不同的DNA片段 变性剂：尿素和甲酰胺
原理：不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，
所以其解链区域及各区域的解链条件变性剂浓度也是 不一样的。同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中 不同位置处达到各自最低解链区域的变性剂浓度，因 此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链，导致迁 移速率大大下降，从而在被区分开来。
DGGE
1、分析微生物群落结构组成。 可用于各种微生物生态系统，包括土壤、活性污 泥、人体和动物肠道、温泉、植物根系、海洋湖泊、 油藏等等。 绝大部分研究通过扩增细菌和古细菌的16SrRNA 基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。 也可用真菌的通用引物扩增18SrRNA基因。
SEM及PCR-DGGE实验步骤
SEM及PCR-DGGE实验步骤一、扫描电镜实验1、污泥样品预处理方案一：（1）取样：自反应器中取数颗颗粒污泥，放入5ml的离心管中，用去离子水清洗数次，弃去上清液。
（2）固定：加入2.5%，pH为6.8的戊二醛使淹没泥样，并置于4℃冰箱中固定过夜。
（3）冲洗：用1mol/L pH为7的磷酸缓冲溶液冲洗3次，每次15min。
（4）脱水：用浓度为30%，50%，70%，80%，90%的乙醇进行脱水，每次15-30min，再用100%乙醇脱水2次，每次15-30min。
（5）置换：用乙醇：乙酸异戊酯为1：1的溶液，纯乙酸异戊酯各置换一次，每次15min。
（6）干燥：将置换后的样品用针头挑出，放入滤纸叠成的小盒中，置入干燥器中干燥8h。
（7）喷金：用离子溅射镀膜仪（IB-5（Giko）型）在样品表面镀上一层1500nm 厚度的金属膜。
（8）观测：将处理好的待检泥样置于扫描电镜下观察。
方案二：颗粒污泥扫描电镜观察的样品预处理方法如下：（1）取样与清洗：在所需要的不同的反应阶段，从反应器中取出数颗好氧颗粒污泥，放入5mL 的离心管中，用去离子水清洗数次，弃去上清液。
（2）固定：把清洗好的颗粒污泥加入2.5%，pH 为6.8 的戊二醛溶液并淹没样品，并置于4℃冰箱中固定2-12 小时。
（3）冲洗：固定好的好氧颗粒污泥，用0.1mol/L，pH 值为6.8 的磷酸缓冲溶液冲洗3 次，每次10min。
（4）脱水：采用梯度乙醇脱水，将冲洗好的样品依次置于系列浓度50%、70%、80%、90%的乙醇进行脱水，每次10-15min，再用100%的乙醇脱水3 次，每次10-15min。
（5）置换：用乙醇：乙酸异戊酯为1：1 的溶液，纯乙酸异戊酯各置换一次，每次15min。
（6）干燥：将置换后的样品小心取出，放入滤纸叠成的小盒中，置入干燥器中干燥8 小时。
（7）粘样与喷金：将干燥好的颗粒污泥样品，用镊子小心取出干燥好的样品，用导电胶把颗粒样品粘附在铝制托盘上，之后用离子溅射镀膜仪（IB-5（Giko）型）在样品表面镀上一层1500nm 厚度的金属膜。
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EB法染色的灵敏度最低。 SYBR Green I和 SYBR Gold 相比 EB，能更好地消除染 色背景，此它们的检测灵敏度比 EB 法高很多。 EB 和 SYBR 染色时，双链 DNA 能很好地显色，单链 DNA基本上不能显色。 银染法的灵敏度最高， 它不但能染双链 DNA， 也能染 单链 DNA，它的缺点是不能用于随后的杂交分析 。
3 DGGE分析
（2）电泳
上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。 PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入 缓冲液。
上样时上样器要深入胶孔底部。
尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有marker lane。 将胶放入电泳槽中时注意正负极。 建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。
谢谢！
缺点
(1)只能分离较小的片段 ( < 500 bp) ,对于大片段的分离效率下降 (2)DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的菌株 ,或是在不同的泳道中 移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成 (3)DGGE通常显示群落中优势种类的 r DNA片段,只有占整个群落细菌数量 约 l%或以上的类群能够通过 DGGE检测到。 (4)由于某些种类的 16S r DNA不同拷贝之间的多态性问题 ,可能导致自然群 落中细菌数量的过多估计。 (5)DGGE技术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库 ,若数据库中基因序列 信息不够丰富 ,将会限制 DGGE的使用。 (6)需要专门设备，用计算机对序列进行分析， (7)需要进行预实验 昂贵的“ GC 夹板” 用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶 (8)无法确定突变在 DNA 片段中位置
获得高质量的DGGE图谱。 DGGE条带的回收 －－注意紫外条件下操作的安全。 －－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。 －－不同长度目标片段从切胶条带中的回收。 测序注意要点 －－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆 －－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测 序 －－每个条带至少测3个克隆
多样性指数的计算
用Quantity One（Bio-Rad，USA）软件对DGGE图谱进行 数字化处理。按照如下公式计算多样性指数（ShannonWiener index）
其中，s代表每泳道中的条带数量；Pi为泳道中第i条带灰度 （height of the peak）占该泳道总灰度的比例。 菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=ln S
环境微生物新技术
聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳 PCR-DGGE （Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
汇报人： 学号：
目录
（一） DGGE的简介 （二） DGGE的定义 （三） DGGE的基本原理 （四） PCR-DGGE的操作流程 （五） DGGE的优缺点 （六） DGGE的应用
目标片段的PCR扩增
电泳前准备工作
DGGE 分析
电泳分析
剥胶、染色
图像的采集和条带的回收
DGGE条带测序
DGGE图谱的分析
总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提 取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。 适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率 ②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性 ③制备DNA花费时间的长短。 关于DNA提取的建议： 优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯 仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产 品） 。
变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，
DGGE)最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来
检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物 群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳 （temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后十年间， 该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研
优点
（1） DGGE的最大优点就是无需进行微生物培养，且能检测出难以或不能培 养的微生物，同时检测多种微生物 （2）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上几乎可以检出所有突变 （3）可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 （4） 无须标记 。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成 的伤害。 （5)操作简便、快速、重复性好、结果准确可靠。电泳前只需一步操作， DGGE一般在24小时内即可获得结果。 PCR-DGGE方法则能客观完整地鉴定 微生物，根据参考菌株和样品16S rRNA的PCR产物在凝胶中的相对位置来 进行判断．若割胶测序，然后序列比对，就可以得出遗传相关性 （6)可用于未经扩增的基因组 DNA ,可检测出象甲基化这样的 DNA 修饰
DGGE图谱的聚类分析、相似性分析：DGGE 胶通过扫描仪输
入计算机,通过Molecular Analysis软件进行相似性分析。通过DGGE 后得到的指纹图谱,每一个条带代表某个微生物优势菌群,通过测序和 序列比对,可以得出此优势菌群的种类。
DGGE图谱的主成分分析
DGGE图谱的数字化——Quantity one
使用对象：长度相同但序列不同的DNA片段 变性剂：尿素和甲酰胺 DGGE不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂 浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。 原理：根据DNA的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求 的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺 凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应 的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶 中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。
DGGE是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。 核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变 性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值取决于DNA分子中G-C含量的多少。 DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60℃，变性剂0~100%。 DGGE的成功有赖于双链DNA内部低温解链部分变性后迁移率的改变。 但在相当于最高Tm的变性剂浓度的位置，相应的DNA片段可能全部解链，使 实验无法检出存在于高TmDNA片段中的碱基替换。为了解决此问题。可以在 一个PCR引物的5'端设计一段富含G-C的尾巴，从而使扩增产物富含G-C碱基 对（30~40bp),保证了绝大多数DNA片段不会发生完全解链，在最高变性剂浓 度区域仍然可以分辨出部分解链的异源双链，这一改进使DGGE的突变检出率 接近100%。
注意事项
1． 配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要 用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 2． 制胶是实验的关键。在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮， 将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3． 灌完胶后，立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。 4． DGGE 的电泳缓冲液要超过“RUN”刻度线，不要超过 “Maximam”刻度线。 5． 点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样。 6． 银染的整个过程中，一定要戴手套。以避免手接触胶而带来的 污染。 7． 每次用完仪器后要及时清理，清洗玻璃板培养皿等玻璃仪器。
DGGE的分类
根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE和平行DGGE （1）垂直DGGE，变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野 生型和变异型的最佳变性剂梯度范围; （2） 平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确 的DNA片段的检测
环境样品基因组DNA的提取
• 选择适合的目标片段，设计合适的引物，注意有GC夹子 情况下引物二聚体的行程。 • 环境样品目标片段的扩增最好采用Touch down PCR。 • 注意PCR的环境，V3区产物扩增极易污染。
DGGE的操作流程主要有：制胶 点样 电泳 显色 成像分析
（1）DGGE前的准备工作
从这一步开始，带上手套。 1.配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意 变形溶液中大颗粒的过滤及脱气。 2.制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 3.灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品摆放的位置。 4.制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀 速地灌入玻璃板。 5.灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。
究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝 胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁 移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂 梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性 剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部 分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性， 因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标 记方法。