-第十四章高效液相色谱法

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附属系统 • • • • • • • 脱气 梯度淋洗 预饱和柱和预柱 恒温 自动进样 馏分收集 数据处理
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梯度淋洗(gradient elution)
梯度淋洗是指在分离过程中使流动相的组成随时间改变 而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强 度或pH等因素，使被测组分的相对保留值得以改变，提 高分离效率。梯度淋洗对于一些组分复杂及容量因子值 范围很宽的样品分离尤为必要。 HPLC中的梯度淋洗的作用十分类似于气相色谱中的程序 升温，两者的目的都是为了使样品的组分在最佳容量因 子值范围流出柱子，使保留时间过短而拥挤不堪、峰形 重叠的组分或保留时间过长、峰形扁平、宽大的组分， 都能获得良好的分离。 梯度淋洗的优点： 可以改进复杂样品的分离，改善峰形，减少拖尾并缩短 分离时间。另外，由于滞留组分全部流出柱子，可保持 柱性能长期良好。
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混合溶剂
优化保留值k和分离选择性α的重要方法是改变流动相溶剂 类型和组成。 溶剂组成优化用差试法比较麻烦、费时，成功率不一定很 高。采用溶剂组成与溶剂强度参数关系的估算,可减少优化实验 操作。二元混合溶剂极性参数P’与其体积组成呈线性关系，可 按算数平均值求出。例如溶剂A和B混合物的极性参数PAB’可按 下式求出:
高效液相色谱与经典液相色谱比较
气相色谱 只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物 不能分析热不稳定物质 用毛细管色谱可得到很高的柱效 有很灵敏的检测器如ECD和较灵 敏的通用检测器(FID和TCD) 流动相为气体，无毒，易于处理 运行和操作容易 仪器制造难度较小 高效液相色谱 几乎可以分析各种物质 可以分析热不稳定物质 色谱柱不能很长，柱效不会很高 没有较高灵敏的通用检测器 流动相有毒，费用较高 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度大
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荧光检测器(Fluorescence Detector，FD)
高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应。
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示差折光检测器 （Differential Refrative Index Detector, RI）
除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每 种物质具有不同的折 光指数）； 灵敏度低、对温度 敏感、不能用于梯度 洗脱； 偏转式、反射式和 干涉型三种。
进 样 阀
高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm）， 所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色 谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接 管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展 宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相 色谱法中对进样技术要求较严。
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高压输液系统 • 储液罐 • 高压输液泵 要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可
调流量范围宽，耐腐蚀
多 用 于 流 量 要 求 在 150µL/min范围的微型HPLC 或毛细管柱HPLC中 活塞泵
分类：恒流泵（机械泵） 机械注射泵
机械往复泵
恒压泵 • 过滤器 • 压力脉动阻力器
隔膜泵
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进样系统
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检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 • 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物 理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、 荧光、电化学检测器等。 • 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的 物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差 折光，电导检测器等。
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液相色谱检测器
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正相色谱和反相色谱
根据固定相和液体流动相相对极性的差别，有正相色谱和 反相色谱两种色谱体系或方法。 反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极 性，（反相：流动相的极性大于固定相；正相：流动相的 极性小于固定相）。最初形成于液液分配色谱，现已广泛 应用于其他各种色谱方法。
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高效液相色谱仪
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高效液相色谱柱 1.色谱柱类型 按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半 制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。 2.保护柱 一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除 去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中 含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的 分析柱，延长使用寿命。 3.柱恒温器 对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留 值和更好分离色谱图。
普通检测器
光电二极管阵列检测器 21
光吸收检测器 3. 红外吸收检测器 与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口 采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池 的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可 提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相 溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。
高效液相色谱与经典液相色谱比较
经典液相色谱 常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测 高效液相色谱 高压，40～50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000～60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便
1.储液瓶（输液管入口端安装有 过滤器）；2.高压输液泵；3.混合 器和阻尼器；4.进样器（阀）；5. 色谱柱；6.检测器；7.废液瓶；பைடு நூலகம். 数据处理和控制系统
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流动相贮器和溶剂处理系统
现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一 般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮 (PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积500~2000mL。 储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵 启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排 出。 储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这 些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常 工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超 声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶 剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一 步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵 塞色谱柱。
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进样装置 隔膜注射进样器 色谱柱顶端装入耐压弹性隔膜，进样时用
微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。
高压进样阀 （六通阀）
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分离系统
色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相 两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚 合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充 物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为 其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定 相，保证分离技的性能不受影响。
l. 光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极管阵列检 测器，红外吸收检测器 2. 荧光检测器 3. 示差折光率检测器 4.电化学检测器 5. 蒸发光散射检测器 6. 质谱检测器
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光吸收检测器 1. 紫外吸收(UV) 检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很 小（1mm × 10mm ，容积 8μL）；对流动相的流 速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用 于梯度洗脱。
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电化学检测器
基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测，主要有安 培、极谱及电导等几种类型，适用于测定具有电化学氧化还原 性质及电导的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、 阳离子等。
1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或 聚酯垫片,4.接参比电极，至废液，5. 接色谱柱。
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蒸发光散射检测器 (Evaporation Light Scattering Detector, ELSD)
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流动相
溶剂的特性参数
1.溶剂强度参数ε0 定义为溶剂分子在单位吸附剂表面积上的吸附自由能，表征溶剂分子 对吸附剂的亲和力大小。 2.溶解度参数δ 它是溶剂与溶质分子间各种作用力的总和，包括色散力、偶极作用力、 接受质子能力、给于质子能力等。 3.极性参数P’ 表示每种溶剂与乙醇、二氧六环和硝基甲烷三种极性物质相互作用力 的度量，类似于气相色谱固定液的Rohrschneider常数，反映溶剂接受质子、 给出质子和偶极相互作用能力及选择性差异，亦作为表征溶剂洗脱强度的 指标。
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流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力， 并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响 组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： 1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保 证柱的稳定性和分离的重现性。 2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶 剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压; 弱或无紫外吸收等，以降低UV检测器本低响应，提高检测灵敏 度;对样品具有适当溶解能力等。 3.溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价廉等，便 于操作和安全。
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2.紫外光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各 检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如 图所示。
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20.2.5.1.光吸收检测器
2.紫外光电二极管阵列检测器
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20.2.5.1.光吸收检测器
2.紫外光电二极管阵列检测器
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紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较
第十四章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
概述
概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末， 以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵 敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离 分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目 前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段。 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操 作自动化。