第十四章 附肢的发育

间质细胞分泌的因子可能是FGF10，其他的 FGF因子如FGF2、FGF4和FGF8虽然也可以 诱导AER的形成，但FGF10合成的时间和位 臵都是适当的。 FGF10能够诱导鸡胚背腹交界处的外胚层形 成AER。在背部化的肢芽突变体中，由于 没有背腹交界，便不能形成AER。
扫描电镜观察孵 化4.5 天的鸡胚肢 芽，显示顶外胚 层嵴AER。
附肢发育中至少要求三种类型的外胚层和 中胚层间的相互作用：第一，中胚层起始 附肢芽向外生长和形成AER；第二，AER 进一步刺激肢芽的向外生长以及肢芽中胚 层的增殖和分化；第三，附肢芽中胚层提 供保持AER所必须的刺激。
五、附肢发育时期轴的建立


脊椎动物完全形成的附肢包含三个轴的发 育：近远轴（proximal-distal, P-D）、背腹 轴（dorsal-ventral，D-V）和前后轴 （anterior-posterior, A-P）。 附肢发育中三个轴的建立具有各自的时间 性，它们好像是按下列顺序决定的：前后 轴、背腹轴和近远轴。
A，RA处理蝌蚪的尾巴引起肢的再生； C，RA处理 促进肢芽的形成（箭头所指部位）。
二、附肢的早期发育
1 附肢发育中外胚层和中胚层间的相互作用

附肢发育起始于肢场侧板中胚层（四肢骨 的前体）和体节中胚层（四肢肌肉的前体） 间质细胞的增殖。
体节中胚层细胞沿胚胎长轴的增殖，逐渐 在表皮的下面形成厚的间质细胞团，可能 与两对附肢形成的位臵有关。
美西螈（Ambystoma maculatum）的预定前肢场
Hyla regila的早期 后肢场被许多寄 生的线虫卵分隔 开，形成多附肢 的蝌蚪，示附肢 场的调整能力。



视黄酸RA对于肢芽的向外生长具有重要的 意义。用药物阻断RA的合成，将抑制肢芽 最初的形成。 Hensen’s结可能是产生RA的源泉。沿身体 前后轴呈梯度分布的RA可以激活某些同源 框基因，促使这些细胞形成肢场。RA还可 以引起再生尾中的同源转化现象（homeotic transformation） 。


从体节发出的信号参与背部外胚层的确定。 在鸡翅芽中，背腹外胚层界线的建立明显 有来看Notch受体信号的参与。 含有homeobox的基因Engrailed-1在AER形 成之前就已经在附肢腹部的外胚层特异地 表达，有可能特化为将来的腹部区域。
外胚层控制发育中肢的背腹轴图式的形成。Wnt-7a在背部外 胚层中表达，而Engrailed基因在腹部外胚层中表达。lmx-1基 因在背中胚层中被Wnt-7a诱导表达，并且参与背部结构的确 定。
鸡胚胎的肢芽。孵 化后第三天胚胎的 侧面出现肢芽


许多脊椎动物胚胎中的预定附肢区 （prospective limb area）已被定位。能形成 一个附肢的所有细胞，称为附肢场/域 （limb field），包括位于中央的、产生附肢 本身的中胚层细胞（附肢盘，limb disc）以 及形成周围的躯干组织和肩带/腰带的细胞。 附肢场起初具有调节失去或增加部分附肢 的能力，附肢场中的每个细胞都能被指令 形成附肢的任意一部分。
近远轴的发育


附肢沿近远轴的分化是由AER和附肢中胚 层诱导的相互作用产生的。附肢芽的逐渐 向外生长是由于位于AER下面间质细胞的 增殖，而AER释放的分子维持间质细胞不 断进行分裂。 由AER合成、释放到其下的间质中的成纤 维细胞生长因子FGF可能是鸡胚中维持间质 细胞增殖的分子。
AER和附肢 芽中胚层的 相互作用
鸡胚趾间细胞的程序性死亡信号可能由BMP发出，封 阻BMP的受体将会阻止这些细胞的程序性死亡。


在附肢的正常发育过程中，BMP既可以诱 导间质细胞发生凋亡，也可以刺激它们分 化为软骨形成细胞，这要取决于它们所处 的发育阶段。 在关节形成过程中，BMP7可以促进软骨的 形成，而BMP2和GDF5在骨之间的位臵表 达，促进关节的形成。
第十四章 附肢的发育


附肢发育的研究是发育生物学的一个重要 课题。脊椎动物，特别是鸟类和两栖类附 肢（limb）的发育包含了大量的、各种各样 的诱导作用。 有尾类的蝾螈和美西螈附肢具有明显的再 生能力，是研究再生的极好模型。
第一节 脊椎动物附肢的发育


脊椎动物的附肢是一个极其复杂的器官， 每一块骨和肌肉的位臵都被精密地组织在 一起。附肢在三个基本轴上是不对称的， 但左前肢总是和右前肢呈镜面对称。 脊椎动物的附肢都是由体壁中胚层和外部 的表皮共同组成的。
一、附肢的起源
附肢场的形成：Hox基因和视黄酸RA


脊椎动物的附肢在起源上是由胚胎体壁向 外生长形成的，主要是由来自中胚层的疏 松间质形成的中央核，以及来自外胚层的 表皮两大部分组成。 附肢的原基称为附肢芽（limb bud）。附肢 芽形成的位臵在每一物种是恒定的，由Hox 基因沿身体前后轴表达的水平决定。
FGF10的表达及其在鸡肢发育过程中的作用。
三、前肢和后肢的特化


Gain-of-function实验结果表明，转录因子 TBX4和TBX5分别与后肢和前肢的特化有 关。 Loss-of-function资料也表明，人类TBX5基 因缺失会导致上肢和心脏的异常，但下肢 基本不受影响。
TBX4 和TBX5在肢型特化中的作用
鸡前肢内骨的排列模式及其不对称性
孵化10天的完整鸡翅标本，示三个发育轴：近侧-远 侧轴、前后轴及背腹轴。


在所有的四足动物中，附肢发育的基本形 态发生原则（basic morphogenetic rules）是 相同的。 构建一个附肢所需要的位臵信息要在一个 三维（或包括时间在内的四维）的、相互 协调的系统中发挥作用。现在已鉴定了一 系列蛋白，在附肢近远轴、前后轴和背腹 轴的形成过程中发挥作用。
TBX4和TBX5在FGF10诱导形成的肢芽中的表达
异位表达 TBX4，可 以使FGF10 诱导形成的 前肢转变为 后肢
四、顶外胚层嵴的形成

随着鸟类和哺乳类的中胚层间质细胞进入 肢区，它们分泌的因子诱导肢芽顶端前、 后边缘的外胚层细胞伸长，形成一个增厚 的特殊结构，称为顶外胚层嵴（apical ectoderm ridge，AER）。AER是一个临时 的结构，对于附肢的继续向外生长是至关 重要的。
六、同源基因在附肢发育中的作用
现代研究认为附肢是通过特异基因在特定细 胞中的表达决定的，同源基因可用于解释 附肢发育中的所有主要现象。

同源基因决定附肢场 附肢场的边界与诱导能力有关，而此边界 是由同源基因的表达模式决定的。

渐进带的相互作用是由msx-1和msx-2基因调 节的 AER和位于其下的间质的相互作用是由msx1和msx-2基因产物调节的。 msx-1基因起初 在整个早期的附肢芽中表达，但此后变得 局限于直接位于AER下方的渐进带间质中 表达。msx-2基因起初是在AER和前部的间 质中的表达。


脊椎动物附肢中特定细胞的死亡是可遗传 的程序性细胞死亡，是进化过程中经自然 选择形成的。 细胞死亡在指/趾的成形过程中，特别是关 节形成和手指的分离中起着重要的作用。
鸭胚和鸡胚后肢原基中细胞死亡模式的比较。
noggin expression
dominant negative BMP receptor

两栖类胚胎中附肢由中胚层起源的图解


覆盖在间质细胞团表面的表皮变得稍微增 厚，同时被包裹在内部的间质细胞团向外 突出，形成肢芽（limb bud）。 肢芽形成的信号是由形成预定附肢间质细 胞的侧板中胚层细胞提供的，这些细胞分 泌的FGF10能够启动上皮和中胚层细胞之间 的相互作用。含有FGF10的磁珠（bead）异 位放臵于上皮下方，会诱导出额外的肢芽。
外胚层嵴顶端对于肢芽近远轴图式的发育是必须的。 从正在发育的肢芽中去除AER，将导致肢芽生长的停 止；在发育后期将AER去除，可得到较为完整的肢。
生长因子可以替代顶外胚层嵴。将AER切除后，移植能 释放生长因子FGF-8的玻璃珠，可使肢几乎正常发育。
背腹轴的分化


在鸡翅中，沿背腹轴有一很清晰的图式。 背腹轴的组成部分是由早期鸡胚胎预定肢 芽区域的外胚层决定，并在背腹轴之间发 育形成顶外胚层嵴。 在突变小鼠中控制着脊椎动物肢的背腹轴 的基因已经被确定。 Wnt-7a基因在肢背部 中胚层图示形成中起到关键作用。
前后轴的特化


附肢芽前后轴的极性是在肢芽能识别之前 就已特化。 有两种主要模型用来解释前后轴的特化。 一种是极化活动区（zone of polarizing activity，ZPA）可扩散形态发生子模型 （ZPA diffusible morphogen model）。另一 种是极性坐标模型（the polar coordinate model）。
附肢的向外生长涉及AER和中胚层间持续的 相互作用。 一旦中胚层诱导其上方的外胚层形成AER， AER与中胚层的相互作用对附肢的向外生 长是最重要的。 中胚层在附肢发育中也起着关键的作用。 AER起初的形成和继续存在依赖于位于其 下方的中胚层。
AER与位 于其下的 中胚层的 相互作用

由同源基因决定前后轴和指的特性 HoxD基因家族（Hoxd-9到Hoxd13）的表达 模式在小鼠附肢芽的后部边缘是重叠的。 这意味着在后部边缘产生小指的细胞表达 所有这些基因，而在前部边缘形成拇指的 细胞只表达Hoxd-9。显然，在不同Hox-D基 因的表达中存在一个编码特化前后指的模 式。
七、细胞死亡与指和关节的形成
BMP蛋白可能参与了软骨的稳定和关节的形成过程。 鸡肢形成晚期，BMP7（A）和BMP2（B）的表达。
Noggin蛋白的作用。C，16.5天正常小鼠前肢中GDF5 在关节形成处表达； D，Noggin缺陷型突变体小鼠中 不表达GDF5，也不形成关节。