原核表达实验参考手册
原核表达步骤
重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 挑测序正确的单克隆接种到 3mLLB（50 μg·mL-1Kan）培养基中，振 荡培养 12h 后，将菌液按 1﹕100 的比例加入到 300 mL LB（50 μ g·mL-1Kan）培养基中 200 r/min 37℃振荡培养至 OD600 为 0.5 —0.6 时，加入 IPTG（使终浓度为 1 mmol·L-1）进行诱导表达， 分 别 在 37 ℃ 诱 导 4h ， 4 ℃ 保 存 备 用 。 未 加 IPTG 诱 导 的 pET-28a-CsFOMT 收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取 50 mL 菌液离心收集细菌，加入 SDS 上样缓冲液，悬浮混匀，100℃ 3 min， 12 000 r/min 离心 1 min，取上清 4℃保存备用。另取 50 mL 菌 液离心收集菌体后用 1×PBS （PH7.4）将沉菌悬起，经过超声波细 胞破碎（20 mm 的变幅杆，400 W，超声 2 s，间隔 5 s，重复 60 次），10 000 r/min 离心 10 min 分离上清和沉淀，上清和沉淀样 品中分别加入 SDS 上样缓冲液，混匀，沸水浴，取上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE（5 %浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果
1. 将已经成功转有重组表达载体 pET-28a-CYP83A1 的表达菌 E. coli. BL21 (DE3)在 LB 固体培养基（50μg/mL Kan）上划线接种培 2. 挑取单菌落，接种于 5 mL 的 LB 液体培养基(50μg/mL Kan) 中，37℃，180 r/min 振荡培养过夜。 3. 取 500 μL 过夜培养的菌液转接入 100 mL 新的 LB 液体培养基 (50μ g/mL Kan) 中 ， 37 ℃ ， 190 r/min 振 荡 培 养 到 菌 液 OD 600 =0.6~0.8。 4. 分组培养：实验组加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，对照组不 加 IPTG， 37℃，190 r/min 诱导培养 6 h。 5. 8000 r/min 离心 2 min，收集细菌，用 1×PBS(0.01 mol/L) 缓冲液悬浮。 6. 冰上超声波破碎，功率 30 w，工作 5 s，间歇 5 s，总时间 2 min。 7. 4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，取 100 μL 上清与等体积的 2×上样缓冲液混合；用 200 μL 1×上样缓 冲液悬浮沉淀，沸水浴 5 min 后，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检 测。
原核表达
3.1重组菌的诱导表达a) 取测序正确的阳性菌以1:100接种于含硫酸卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养3h （OD600约等于0.5）；b) 加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，培养4h；c) 室温8000rpm离心10min收集菌体；d) 弃上清后加入适量50mM PBS（pH7.4）悬浮细菌，反复吹打后，8000rpm离心10min；e) 弃上清，加入培养基1/10体积的50mM PBS（pH7.4）重悬细菌，取1mL超声波破碎（300W，4 S/4S，99次）；f) 12000rpm离心10min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。
3.2 重组蛋白可溶性分析a) SDS-PAGE电泳板的处理用中性洗涤剂清洗后，再用双蒸水淋洗，然后用酒精棉球擦拭，吹风机吹干备用。
b) 15％分离胶的制备在10 mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水 1.1 mL30%丙稀酰胺溶液 2.5 mL1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 mL10% SDS 0.05 mL10%过硫酸铵 0.05 mLTEMED 0.005 mL充分混匀，立即缓慢倒入已固定好的两电泳板之间的狭槽中，马上轻轻覆盖一层双蒸水，室温静置至胶完全聚合，除去上层水相，用滤纸吸干水分。
c) 浓缩胶的制备在10 mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水 1.4 mL30%丙稀酰胺溶液 0.33 mL1.0 M Tris (pH 6.8) 0.25 mL10% SDS 0.02 mL10%过硫酸铵 0.02 mLTEMED 0.002 mL充分混匀，立即缓慢倒入分离胶上层的狭槽中，将样品梳插于槽上部，室温静置，待聚合完全后拔去梳子；d) SDS-PAGE 蛋白电泳缓冲液配制：Tris 3.03gSDS 1.0gGlycine 14.4g 溶于1000ml蒸馏水中。
d) 样品处理分别取上清和沉淀40μL，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液10μL后，沸水浴作用10min，12000rpm离心5 min后取10μL上清作为SDS-PAGE电泳样品；e) 电泳在电泳槽中加满电泳缓冲液，用微量上样器上样。
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
原核表达实验
原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。
实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
c. 10 mg / mL 溶菌酶。
d. 脱氧胆酸。
e. 1 mg / mL DNase I。
2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。
本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。
一( 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达制样 (一)1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Ampo(100mg/mL)，37C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1:50比例(200ul)，将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，o加入10uLAmp(100mg/ml)，37C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。
(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK)，其余ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l)，使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。
7ml菌液加入7o以200r/min的转速，37C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。
5. 加入1ml dHO，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，2倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离心管中的水倒干净。
(二)菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。
用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100?恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。
样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。
原核表达实验技术
TAKARA DNA凝胶回收试剂盒1. 切胶：先用酒精灯消毒手术刀，在酶切仪中切胶，把片段放入1.5ml管中，用枪头搅碎。
2. 加GM试剂溶胶：加入700--800ul左右的GM，放进45℃水浴锅中溶胶。
3. 拿新的过滤柱和离心管，转移溶胶后液体进过滤柱，12000rpm.1min离心，把滤液重新倒进过滤柱，同样离心，后弃滤液。
4. 加WB（加乙醇）清洗：向过滤柱中心加700ulWB，同样条件下离心两次，弃滤液，最后空离30s。
5. 换新的1.5ml离心管，把柱子放入，加30ul的Elution Buffer/DDH2O.（注意要加在中央，不要碰壁）6. 离心1min，把滤液重新加入到过滤柱中，再离心，得到溶解的DNA液体，弃柱子。
7. 保存：-20℃LB培养液制备（1000ml）1. 称量：10g胰蛋白胨粉，5g酵母提取物，10gNacl于玻璃瓶，加DDH2O 1000ml。
2. 灭菌：把盖子拧松，高压蒸汽灭菌121℃，20min。
3. 置室温降温，后放4℃保存。
LB固体培养基制备1. 向100ml的液培中加入1.5g琼脂粉，高压灭菌20min。
2. 抗生素贮存液：卡那霉素（Kan）贮存液50 mg/ml、氨苄西林（Amp）贮存液100 mg/ml (均经过0.22µm 滤膜过滤除菌），-20℃储存，使用浓度卡那（k+）0.05mg/ml，氨苄（A+）0.1mg/ml。
3. 取出培养液，待其温度降至45—50℃时（不烫手），按照1:1000比例加入抗生素，充分混匀。
4. 倒入6cm一次性培养皿中，静置30—60min（等待平板冷却）。
5. 封口胶封口，倒置保存在4℃，期限为30D。
纯化PCR 产物（胶回收）（天根试剂盒）1. 在紫外灯下准确切取含有目的DNA片段的凝胶（体积尽可能小），放入干净的1.5 ml EP 管（预先称取空管重量）中，称取凝胶的重量。
2. 按每0.1 g凝胶加入100 ul PC溶液的比例往EP管中加入溶液PC，50℃水浴放置约10 min，期间不断温和晃动，确保凝胶完全溶解，此时溶液呈现黄色。
蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品１. 材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、T ris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。
2. LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5g pH 7.0NaCl 5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
实验五 原核表达
一、原理
1、 E.coli表达系统
E.coli是重要的原核表达体系。在重 组基因转化入E.coli 菌株以后，通过 温度的控制，诱导其在宿主菌内表达 目的蛋白质，将表达样品进行SDSPAGE 以检测表达蛋白质。 本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖 昔（IPTG）诱导外源基因表达
3.原核表达
1)挑取上述方法得到的单菌落于2 mL LB 液培养基(氨苄青霉素50 μg/mL)中。同 时，BL21作为对照（不加抗生素）。于 37℃培养至OD600为 0.5. 2)取20 μL菌液接种2 mL LB液体培养基 (氨苄青霉素50 μg/mL), 37℃培养OD600 为 0.5， 3)加入IPTG最终浓度梯度2mM ，18℃诱 导表达16h。
大分子
混合样品 电泳 电泳方向 带孔胶
小分子
按分子 大小分离
二、试剂
LB培养基 SOC培养液 50 μg/mL Amp IPTG SDS-PAGE Loading Buffer
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂
30%丙烯酰胺凝胶贮液： 丙烯酰胺30 g， N, N-亚甲双丙烯酰胺 0.8 g 4×Tris· Cl/SDS pH 8.8：18.2 g Tris碱溶 解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为 8.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS。 4×Tris· Cl/SDS pH 6.8：6.05 g Tris碱溶 解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为 6.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS。
聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点
蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的 净电荷以及分子大小和形状等因素。 加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙 醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它 的分子量，而与原来所带电荷、分子形状 无关。
原核表达及蛋白纯化方法
蛋白原核表达预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。
2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。
3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。
4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。
（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的）5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。
6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL 菌液转入1.5 mL 离心管中，12，000 g 离心2 min，弃上清，加入800 μL 超声波反应缓冲液，15% ，超声1 s ，间隔2 s ，反应5 min ，4 ℃，12，000 g 离心2 min，取500 μL 上清，在上清样品中取40 μL 上清加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品B（可溶性蛋白）。
7. 沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500 μL 裂解缓冲液悬浮沉淀，取40 μL 沉淀，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。
原核表达实验报告
原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。
二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。
三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。
2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。
3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。
6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。
四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。
2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。
3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。
6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。
五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。
这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。
原核表达实验
生命科学技术学院 2010年6月
黑曲霉的优化培养 总DNA或RNA的抽提 PCR或RT-PCR扩增xynB基因 目的基因的TA克隆
28S 18S
质粒pMD-xylB
大肠杆菌表达载体pET-28(a)+ EcoRI+XhoI双酶切
凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB 酶连
实验二：大肠杆菌细胞破碎及蛋 白浓度测定
1、取出保存的诱导后的细胞（10ml），在冰上缓慢融化后， 加入1mlPBS缓冲液；
2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液 中，开始超声，10 sec/次，间歇15 sec（避免过度产热）， 重复数次（一般5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在 冰上进行； 3、在4℃、13000rpm离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清 液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；
操作步骤4 一抗杂交
• 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶和合 适稀释度的一抗的TBS-T溶液中（1:1000），孵育 1至2小时；
• 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。
操作步骤5 二抗进行杂交
• 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶 和合适稀释度的二抗的TBS-T溶液中(1:5000)， 孵育1小时；
分离胶配制时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好， 制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和TEMED，将胶液混 合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30 分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。
5%积层胶配制(2ml): 水 1.4ml 30%聚丙烯酰胺 0.33 ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml 10% SDS 0.02ml 10% 过硫酸铵 0.02ml TEMED 0.002 ml
重组蛋白的原核表达
实验三重组蛋白的原核表达、亲和层析及免疫印迹分析一、实验内容1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
2．对重组蛋白进行亲和层析，得到纯度较高的融合蛋白。
3．对纯化结果进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并做蛋白质的Western blot鉴定。
二、实验目的和要求1．了解重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达的原理和实验方法。
2．掌握亲和层析基本原理和操作过程。
3．掌握蛋白质的免疫印迹分析。
三、实验操作步骤1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。
①将在甘油保存的重组蛋白的表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1）取少量分别接种于10ml LA（LB+100mg/L的氨苄青霉素）培养基中，37℃下过夜培养。
②以1：100转接至100mL LA液体培养基中培养至OD 0.5-0.6。
加入0.5mM的IPTG诱导表达，诱导表达温度为18℃，诱导时间为9小时。
③将诱导表达的菌液于10000 rpm离心5 min，收集菌体，-20℃保存。
④将菌体细胞重悬于5mL缓冲液buffer I（20 mmoL/L Tris-HCL pH 8.0，150mmoL/L NaCl）（表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a））或PBS（Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））中。
⑤取0.5ml悬浮液，冰浴条件下进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min。
分别取上清和沉淀，作SDS-PAGE检测，估计可溶性表达比例。
⑥将以上④得到的重悬液在冰浴中进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min，其上清即为蛋白粗提液（BL21（pET-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））或沉淀（BL21（pQE-IL-2））。
原核表达完全手册
根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。
一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。
为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase,GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A （N utilization substanceA, NusA）。
2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。
3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。
一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG 诱导进行表达。
而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和 repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。
当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA 基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。
pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。
在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。
Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origami™ B, Rosetta™和Tuner™。
因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。
BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。
原核表达操作
原核表达操作蛋白质的表达、分离、纯化实验标签：蛋白质表达分离纯化蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
详细实验方法原核表达法实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA ）使镍离子（Ni 2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC ）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒LB 液体培养基氨苄青霉素Washing BufferElution BufferIPTG 蒸馏水胰蛋白胨酵母粉氯化钠仪器、耗材摇床离心机层析柱离心管移液枪枪头盒烧杯玻璃棒实验步骤一、试剂准备1. LB 液体培养基：Trytone 10 g ， yeast extract 5 g ，NaCl 10g ，用蒸馏水配至1000 mL 。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL 。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8M Urea ，10 mM 2-ME ，pH8.0。
4. Washing Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8 M Urea ，pH6.3。
5. Elution Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mMTris ，8MUrea ， 500 mMImidazole， pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
原核表达及抗体制备
猪精子黏附蛋白AWN、PSP、MCP的原核表达及抗体制备实验材料15日龄杜洛克猪睾丸组织。
实验菌株及载体大肠杆菌E. coli DH5α克隆菌株大肠杆菌E. coli BL21表达菌株pET-28a质粒图谱如下：主要试剂主要试剂来源DNA提取试剂盒生工公司质粒小提试剂盒Omega公司胶回收纯化试剂盒Omega公司One Step Cloning 试剂盒Vazyme公司TransStart FastPfu DNA Polymerase 北京全式金公司EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酸酶NEB公司EB核酸染料Bio Teke 公司DNA marker（DM2000）东盛公司5xTAE 本实验室保存IPTG Merck公司卡那霉素（Amp）Tiangen公司中分子量预染蛋白Marker 鼎国昌盛公司乙醇（分析纯）杨凌三立化玻醋酸（分析纯）杨凌三立化玻考马斯亮蓝G-250 Amresco公司丙烯酰胺（Bis-Acr）Amresco公司过硫酸铵（AP）Amresco公司SDS 本实验室保存灭菌水本实验室自制一、基因的克隆1.提取睾丸组织DNA（DNA抽提试剂盒）（1）取约20mg杜洛克猪睾丸组织，用液氮研磨成粉末状，加到1.5ml离心管中，再加入180μl Buffer ACL、20μl Proteinase K溶液，震荡混匀。
在56℃水浴1h；（2）加入200μl Buffer CL，并进行充分颠倒混匀；加入200μl的无水乙醇，并进行充分颠倒混匀；（3）将试剂盒中的吸附柱放入收集管中，用移液器将进行消化了的产物全部加入吸附柱中，静置3min，再用10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；（4）将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加500μl CW1 Solution，室温，10000rpm离心30S，倒掉收集管中废液；（5）将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加500μl CW2 Solution，10000rpm离心30S，倒掉收集管中废液；（6）将吸附柱放回收集管中，在12000rpm，室温离心2min，将残留的CW2 Solution离去；（7）取出吸附柱，放入到一个新的1.5ml离心管中，加入60μl CE Buffer 静置4min，12000rpm，室温离心2min，收集DNA溶液。
原核表达及蛋白质的纯化
原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。
IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。
加入650mL的去离子水，均匀搅拌。
用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。
9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。
10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。
原核表达载体
原核表达体系的构建一、实验材料（1）植物材料：拟南芥（2）载体及菌株：克隆及测序用载体为pMD18-T，购自Takara公司。
宿主菌DH5α。
原核表达载体（pET30c ？）。
（3）PCR引物：登陆GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设计引物。
（4）药品试剂：反转录试剂盒（TaKaRa），质粒小提试剂盒（TIANGEN），胶回收试剂盒，Taq DNA聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切酶（TaKaRa），T4连接酶（TaKaRa），各种DNA和蛋白marker，各种抗生素类，二、方法（1）目的基因的获得（RT-PCR）：拟南芥叶片→mRNA→逆转录→cDNA→PCR →基因（详见王希朝那份）；PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。
先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。
（2）克隆载体的构建：Ⅰ. 目的基因的切胶回收：①在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。
②计算凝胶重量（100 mg相当于100 μl），加入3倍体积solution DE-A，75℃水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。
③加入2倍体积solution DE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min。
④取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600 μl Wash solution，室温12000 rpm离心30 s。
⑤重复步骤④一次。
⑥取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000 rpm离心1 min。
⑦将吸附柱放入新的1.5 mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30 μl 75℃预热的ddH2O，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。
离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
Ⅱ. 目的片断与克隆载体pMD18-T连接：pMD 19-T Simple Vector（T载体，小纸盒子中）1ulInsert DNA 2ul 5uldH2O 2ulSolution I（冰中融化，小纸盒子中，跟T载体一起）5ul（等量）16℃反应30minⅢ. E. coli DH5α感受态细胞的制备：①将E. coli DH5α在LB平板上划线培养过夜。
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（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量 宜在 4555%左右。
（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。
可用计算机进行辅助检索分析。
（5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。
2. PCR 反应组分和条件PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有：10×Reaction buffer，5 μl2 个引物，各 12.525 pmol (终浓度各 0.250.50 μmol/L)4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L模板 DNA，100 ng左右Taq DNA 聚合酶，2.53 UPCR 反应条件一般为：（1）94℃，5分钟（2）94℃变性 3060 秒（3）5055℃退火 3060秒（4）7072℃延伸 3060秒℃ 10分钟（5）725共进行 2535次循环。
循环是步骤（2）和（4）(二) 质粒 DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。
（2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集 菌体。
（3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖 紧管口，快速颠倒离心管 67次，然后，冰浴 5 分钟。
（4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 56次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。
（5）12,000 rpm 离心 10分钟后，小心吸取上清至另一 EP管中。
（6）加 2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5分钟。
（7）12,000 rpm离心 5分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA沉淀。
DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。
2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA纯化方法离心方案（适用于产品 A1330， A1340，A1460及 A1470）（1）12,000 rpm离心 1分钟，以沉淀 110 ml过夜培养物。
（2）用 250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。
（3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 56 次混合。
（4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 56次混合，室温放置 5分钟。
（5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 56 次混合。
（6）室温，最高转速离心 10分钟，回收上清。
（7）将离心柱插入收集管中。
（8）将上清倒入离心柱中。
（9）室温，最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。
（10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将 离心柱重新插入收集管中。
（11）重复步骤（10）（用 250μl Wash Solution）。
（12）室温，最高转速离心 2分钟。
（13）将离心柱插入一个无菌的 1.5 ml微量离心管中。
（14）在离心柱中加 50100μl NucleaseFree Water，室温，最高转速离心 1分钟。
（15）DNA溶液保存在20℃备用。
(三) 质粒 DNA 的中量制备1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET15b/Novablue 甘油菌，37℃培养过夜；℃ 4,000 rpm离心 10分钟以收集菌体；在菌体用 3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡2. 4 ,萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入 6 ml 溶液 II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴 510分钟；3. 加入4.5 ml 溶液 III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和 28.5ml水），轻 摇混合，冰浴 10分钟；4. 4℃，12,000 rpm 离心 20分钟，小心吸取上清至另一个 50 ml离心管中；加入 0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10分钟；5. 室温，10,000 rpm离心 10分钟以沉淀 DNA；6. 在沉淀用 70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于 0.3 ml 的 TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入 EP管中；7. 加入等体积的 5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心 10 分钟以沉淀大分子 RNA 分子；8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置 10 分钟，12,000 rpm 离心 5 分钟以 沉淀 DNA；9. DNA沉淀用 70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于 200 μl含 50100 μg/ml 胰 RNA 酶的 TE缓冲液中， 在 37℃保温 30 分钟；11. 加入等体积的 13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置 5 分钟； 12,000 rpm 离 心 10分钟以沉淀 DNA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于 200 μl TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚氯仿异 戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的 EP管中，并加入 0.1体 积的 3mol/L NaAc (pH 5.2)和 2倍无水乙醇，混匀，40℃放置 30分钟；13. 12,000 rpm 离心 5分钟以沉淀 DNA； DNA沉淀用 70%的乙醇漂洗， 自然干燥， 并溶于 100 μl TE 缓冲液中。
最后，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 DNA进行定量和纯度鉴定。
（四）DNA（PCR 产物或质粒）的酶切1. 一般在 1520μl体积中酶切 0.21 μg的 DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切 反应的体积和 DNA的量。
2. 一般用 78 u 的限制性内切酶酶切 1 μg的 DNA，酶:DNA的比率应小于 25u/μg， 以防止 star activity。
3. 限制性内切酶一般保存在 50%的甘油中，而大于 5%的甘油可能会引起 star activity 或抑制酶切反应。
因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于 5%，也 就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的 1/10。
4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切 酶的活性不低于其最大活性的 50%。
5. 酶切反应的时间一般为 23 小时。
如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。
（五） 从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA（用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR CleanUp System—适用于产品 A9280、A9281 及 A9282）1. 从琼脂糖凝胶中切下含 DNA的胶条，并放入一洁净的 EP管中。
按每 10 mg 胶 条加 10 μl的 Membrane Binding Solution，漩涡震荡，并在 5060℃保温直到胶条完全 溶解；对于 PCR反应物，可直接加等体积的 Membrane Binding Solution混合。
2. 将 SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入 SV微柱，室温放置 1分钟。
3. 10,000 g离心 1 分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。
4. 加 700 μl Membrane Wash Soluton，10,000 g离心 1 分钟，丢弃流穿液，重新将 微柱插入收集管中。
5. 用 500 μl Membrane Wash Solution 重复步骤 4，10,000 g 离心 5分钟。
6. 小心将微柱插入一洁净的 EP管中。
7. 在微柱中加 50 μl NucleaseFree Water，室温放置 1分钟，10,000 g离心 1 分钟。
8. 丢弃微柱，将 DNA储存在 4℃或20℃。
（六）PCR 产物或 DNA 酶切片断与质粒载体的连接1. 常规方法加酶切并回收的质粒载体50100 μg左右及1 μl的T4 DNA 一般在10μl反应体系中，连接酶（35 u/μl），按 PCR产物或 DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为 3:1 的比 例进行连接。
连接反应在 1316℃保温过夜。
2. 快速连接方法可以通过连接 Kit进行。
例如，对于 Takara 公司的连接 Kit，可在载体与插入片段 的混合液（5 μl）中加入 5 μl Kit溶液，16℃保温 2 小时即可。
（七）大肠杆菌感受态细胞的制备1. 单菌落接种于 3 ml LB 培养液中，37℃过夜培养。
2. 取 2 ml 过夜培养物接种于 200 ml LB 培养液中，并且，当 37℃培养至 OD600 为 0.4左右时，转移至 250 ml离心管中，立即冰浴 30 分钟。
3. 在 4℃，3,600 rpm离心 10分钟，弃上清，加 4℃预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液 10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。