原核细胞表达纯化实验设计
原核表达和蛋白纯化流程
原核表达和蛋白纯化流程As scientists, we often encounter the challenge of expressing and purifying proteins in prokaryotic cells. Often, the first step in this process is to select an appropriate expression system. 做为科学家，我们经常面临的挑战是在原核细胞中表达和纯化蛋白质。
在这个过程中，通常的第一步是选择一个合适的表达系统。
One commonly used expression system is E. coli, which offers the advantages of fast growth, inexpensive culture conditions, and well-established genetic manipulation techniques. 一个常用的表达系统是大肠杆菌，它具有快速生长、廉价的培养条件和良好的遗传操纵技术的优势。
After selecting an expression system, the next step is to design a suitable expression vector to insert the gene of interest. 在选择表达系统后，下一步是设计一个合适的表达载体来插入感兴趣的基因。
The choice of promoter, selection markers, and fusion tags are important considerations in the design of the expression vector. 表达载体的选择激活子、选择标记和融合标签都是在表达载体设计中的重要考虑因素。
Once the expression vector has been designed and constructed, it can be transformed into the host cells for protein expression. 在表达载体设计和构建完成后，就可以将其转化到宿主细胞中进行蛋白表达。
模块二 原核表达和纯化 实验报告
模块二原核表达和纯化一、实验目的1、获得最佳的表达条件和纯化方法。
2、学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白技术。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂过硫酸胺，TEMED作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成的网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果更好。
外源基因通过表达载体进入宿主细胞后，会利用宿主的蛋白表达体系表达外源蛋白。
理论上看，只要载体具有良好的表达调控元件，就能成功地表达。
但实际情况不是这么简单。
(1)每次转化获得的菌落，其表达外源蛋白的潜力可能是不一样的。
我们一般认为，同样的质粒和感受态细胞，虽然长出来了不同菌落，但显然它们的遗传物质是一模一样的，所以蛋白表达潜力也应该是一模一样的。
因此认为不同菌落具有不同表达外源蛋白潜力这种说法显然是经验之谈。
可以多挑几个菌落做后续测试。
(2)因此，无论何种条件下外源蛋白表达出来了，接下去的工作是在-70℃冰箱好好地保存菌种。
(3)IPTG是控制外源基因表达的开关，外源蛋白的表达将占用细菌本身的蛋白合成机器和能量，自身的繁殖将减弱。
在更高OD600时诱导，有更高的生物量，通常可以产生更多的外源蛋白。
但IPTG诱导的时间点并非可以无限地延迟，有的细胞在高OD600时诱导可以达到很好的表达的效果，但有的细胞诱导时机一旦OD600 > 0.5，就不表达外源蛋白。
适中的诱导时间点可以设置OD600 = 0.8。
(4)IPTG浓度？通常不是主要因素。
在0.2mM诱导不出的即使加到1mM也不会出来。
(5)诱导时间要进行测试，诱导之后每隔2hr取样检测。
(6)小体积（<200ml）摸索出来的最佳诱导条件，在大体积中（>1L）经常不适用。
所以每次改变系统，通常要重新来过。
(7)当测试完以上条件，还无法表达出蛋白，那么只能重新构建载体，改造外源基因让其更长或更短，还要重新检查外源基因是否有大肠杆菌不喜欢的密码子。
原核细胞表达纯化实验设计
原核生物分离纯化实验设计将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:（1)选择标志的编码序列；（2)可控转录的启动子；(3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测操作步骤(一）获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT—PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体.(三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Ampr）作筛选，挑取单克隆，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
原核表达实验报告 -回复
原核表达实验报告-回复实验目的：本实验旨在探究原核表达的过程和原理，分析原核表达实验的步骤和相关技术应用。
引言：原核表达是生物学领域中常用的实验技术之一，它可以通过转录和翻译过程将外源基因导入到原核细胞中并使其表达出目标蛋白质。
原核表达在基因工程、药物研发、蛋白质生产等方面起着重要作用。
了解原核表达的过程和原理，掌握其实验步骤和技术应用，对于学习和应用相关领域的研究都具有重要意义。
实验步骤：1. 选择合适的原核表达系统：原核表达系统主要包括细菌和酵母两种。
在选择表达系统时，需要考虑目标蛋白质的生理特性和产量需求等因素。
细菌表达系统常用的有大肠杆菌(E. coli) 和拟杆菌(Bacillus subtilis)，而酵母表达系统则常用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2. 构建表达载体：构建表达载体是原核表达实验的关键一步。
通常采用的是重组DNA技术，将目标基因插入载体中。
载体中包含启动子、选择标记物和阻遏子等元件，以控制和增强目标基因的表达。
3. 转化表达细胞：将构建好的表达载体导入到表达细胞中。
常用的转化方法有化学法、电转化法和热冲击法等。
通过转化，表达载体成功导入到细胞内。
4. 选择和培养表达阳性克隆：转化后的细菌需要进行筛选，得到表达阳性克隆。
通常通过选择标记物（如抗生素）对未转化细胞进行抑制，从而判断转化是否成功。
表达阳性克隆可通过液体培养或固体培养等方式进行扩增。
5. 蛋白质表达和纯化：经过培养扩增的表达阳性克隆可进行蛋白质表达和纯化。
比较常用的方法有亲和层析、离心扩增和玻璃珠破碎等。
实验技术应用：1. 蛋白质生产：原核表达广泛应用于大规模蛋白质生产。
通过原核表达系统，可以高效地表达大量目标蛋白质，满足科研和工业生产的需求。
2. 蛋白质互作研究：原核表达技术可用于研究蛋白质的互作关系。
通过表达不同蛋白质，进行蛋白质相互作用的分析，有助于揭示蛋白质功能和信号转导网络等。
原核表达及纯化总结
LB 液体培养基，37℃
200rpm/min 培养 3-
所用试剂：
12000rpm 离心 5 min
↓
取上清（350μL），加入 1/10 体积（35μL）的 NaAc（3M）
和 2 倍体积预冷的无水乙醇（700μL）上下颠倒 5 次，（无水乙醇在-20℃保存）
↓
室温放置 20min（-20℃沉淀效果更好）
↓
12000rpm 离心 5 min
↓
取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀
↓
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，通力根1保过据护管生高线产中敷工资设艺料技高试术中卷0资不配料仅置试可技卷以术要解是求决指，吊机对顶组电层在气配进设置行备不继进规电行范保空高护载中高与资中带料资负试料荷卷试下问卷高题总中2体2资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况1卷中下安，与全要过，加度并强工且看作尽护下可1都关能可于地以管缩正路小常高故工中障作资高；料中对试资于卷料继连试电接卷保管破护口坏进处范行理围整高，核中或对资者定料对值试某，卷些审弯异核扁常与度高校固中对定资图盒料纸位试，置卷编.工保写况护复进层杂行防设自腐备动跨与处接装理地置，线高尤弯中其曲资要半料避径试免标卷错高调误等试高，方中要案资求，料技编试术写5、卷交重电保底要气护。设设装管备备置线4高、调动敷中电试作设资气高，技料课中并3术试、件资且中卷管中料拒包试路调试绝含验敷试卷动线方设技作槽案技术，、以术来管及避架系免等统不多启必项动要方高式案中，；资为对料解整试决套卷高启突中动然语过停文程机电中。气高因课中此件资，中料电管试力壁卷高薄电中、气资接设料口备试不进卷严行保等调护问试装题工置，作调合并试理且技利进术用行，管过要线关求敷运电设行力技高保术中护。资装线料置缆试做敷卷到设技准原术确则指灵：导活在。。分对对线于于盒调差处试动，过保当程护不中装同高置电中高压资中回料资路试料交卷试叉技卷时术调，问试应题技采，术用作是金为指属调发隔试电板人机进员一行，变隔需压开要器处在组理事在；前发同掌生一握内线图部槽 纸故内资障，料时强、，电设需回备要路制进须造行同厂外时家部切出电断具源习高高题中中电资资源料料，试试线卷卷缆试切敷验除设报从完告而毕与采，相用要关高进技中行术资检资料查料试和，卷检并主测且要处了保理解护。现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
《原核表达实验》课件
克隆表达载体
选择合适的表达载体，根据载体和目标基因序列的特点进行克隆操作。注意 避免操作中可能发生的错误。
转化表达宿主菌
根据实验要求选择适当的表达宿主菌，通过化学方法、热激转化等方式将表 达载体导入宿主菌中，并对转化结果进行鉴定。
培养表达
根据所选宿主菌的特性和表达需求，进行培养条件的优化。添加适当的诱导 剂，控制表达过ห้องสมุดไป่ตู้的时机和水平。
《原核表达实验》PPT课 件
原核表达实验PPT课件
简介
原核表达实验是一种常用的生物学实验方法，用于在原核生物中大量表达蛋 白质。通过本课程，了解原核表达实验的重要性和应用。
实验流程
1
克隆表达载体
2
选择合适的表达载体，并进行克隆操作，
确保载体和目标基因的正确组装。
3
培养表达
4
在适当的培养条件下，添加诱导剂，使
宿主菌表达目标蛋白质。
5
制备DNA模板
从适当来源获取DNA模板，构建表达载体， 为实验做好准备。
转化表达宿主菌
选择合适的表达宿主菌，通过转化方法 将表达载体导入宿主菌中。
纯化蛋白质
根据需要选择合适的方法进行蛋白质纯 化，以获取高纯度的目标蛋白质。
制备DNA模板
DNA模板的来源包括基因库、PCR产物等。构建表达载体，并根据实验需要制备适量的DNA模板，为后续实验 做好准备。
纯化蛋白质
根据目标蛋白质的特性和实验要求，选择适当的纯化方法，例如亲和层析、离子交换层析等，保证纯度和活性。
结论
通过学习原核表达实验，我们可以更好地理解蛋白质的结构和功能，并为未来的科研工作提供有力的支持。 总结原核表达实验的优缺点，展望其在未来科学研究中的应用前景。
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
原核表达实验
生命科学技术学院 2010年6月
黑曲霉的优化培养 总DNA或RNA的抽提 PCR或RT-PCR扩增xynB基因 目的基因的TA克隆
28S 18S
质粒pMD-xylB
大肠杆菌表达载体pET-28(a)+ EcoRI+XhoI双酶切
凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB 酶连
实验二：大肠杆菌细胞破碎及蛋 白浓度测定
1、取出保存的诱导后的细胞（10ml），在冰上缓慢融化后， 加入1mlPBS缓冲液；
2、置冰上用超声波破碎细胞，将超声波发射探头插入菌液 中，开始超声，10 sec/次，间歇15 sec（避免过度产热）， 重复数次（一般5-6次）直至溶液变清亮；所有过程均需在 冰上进行； 3、在4℃、13000rpm离心20分钟，可溶性蛋白存在于上清 液中，不溶性蛋白存在于沉淀中；
操作步骤4 一抗杂交
• 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶和合 适稀释度的一抗的TBS-T溶液中（1:1000），孵育 1至2小时；
• 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。
操作步骤5 二抗进行杂交
• 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶 和合适稀释度的二抗的TBS-T溶液中(1:5000)， 孵育1小时；
分离胶配制时，过硫酸铵和TEMED先不加，将制胶板跟电泳槽装配好， 制胶板凹面朝向自己方便注胶，然后加入过硫酸铵和TEMED，将胶液混 合均匀后注入制胶板中，再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30 分钟，待胶完全凝固，去除正丁醇。然后配制积层胶。
5%积层胶配制(2ml): 水 1.4ml 30%聚丙烯酰胺 0.33 ml 0.5M Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml 10% SDS 0.02ml 10% 过硫酸铵 0.02ml TEMED 0.002 ml
设计实验方案,在原核细胞中表达人的生长激素基因
设计实验方案,在原核细胞中表达人的生长激素基因实验目的：设计实验方案，通过基因工程技术在原核细胞中表达人的生长激素基因，以进一步了解生长激素对细胞生长和发育的调控机制。
实验步骤：1. 制备载体：选择合适的质粒载体，如pUC19或pET系列，设计引物，将人的生长激素基因克隆到载体上，构建重组质粒。
2. 转化细菌：将重组质粒转化到大肠杆菌等常见原核细胞中，使用热激法、电转法或化学法等方法，将重组质粒导入细菌细胞内。
3. 筛选转化菌落：在含有适当抗生素的培养基上培养转化细菌，筛选出带有重组质粒的菌落。
通过PCR、酶切等方法进行初步鉴定。
4. 扩大培养：将带有重组质粒的菌落进行扩大培养，获取足够的重组细菌。
5. 表达生长激素基因：在适宜的培养条件下，诱导转化细菌中的重组质粒表达人的生长激素基因。
诱导条件可根据实验需要进行调整，常用的诱导方法包括添加异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）等。
6. 收集表达产物：在诱导表达后，收集细菌培养物。
通过离心等方法将细菌细胞分离，得到包含表达产物的上清液。
7. 分离纯化表达产物：通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等方法，对上清液中的表达产物进行分离纯化。
8. 鉴定表达产物：利用酶活性测定、SDS-PAGE电泳等方法，对纯化后的表达产物进行鉴定，确定其纯度和功能性。
拓展实验：1. 基因敲除实验：通过CRISPR-Cas9等基因编辑技术，敲除原核细胞内某些与生长激素相关的基因，观察细胞生长和发育的变化，以验证生长激素对细胞的调控作用。
2. 转基因动物模型：将表达人生长激素基因的原核细胞转化为转基因动物模型，如小鼠，观察其生长发育情况，进一步验证生长激素的作用机制。
3. 蛋白质相互作用研究：通过免疫共沉淀、荧光共激发等技术，研究生长激素与其他细胞因子、受体等蛋白质的相互作用，探究其参与的信号转导通路和调控网络。
4. 表达产物的生物活性研究：将纯化后的表达产物应用于细胞培养系统或动物模型中，观察其对细胞增殖、分化、器官发育等生物过程的影响，进一步阐明生长激素的生物学功能。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定
记录测定结果。
用灭菌水清洗侦测台5-6次，退出系统，关闭计算机。
防止二价Ni被还原。
不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失。 建议在破碎细胞的时加入蛋白酶抑制剂，如0.11mM的PMSF，防止目的蛋白被降解。
缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水
相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）。 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间。 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween等，最 高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。
GST标签蛋白的纯化
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm 离心1min集菌，然后用 PBS洗涤诱导后的菌体2-3次，Buffer A（一般用1/10体 积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm离心 20min取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的 Glutathione Sepharose 4B，室温摇床轻轻晃动作用1h，使 蛋白充分吸附。 • 2000 rpm离心5min，弃上清。 • 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B 悬浮于溶液中，2000rpm离心5min弃上清。 • 重复上步两次。
蛋白浓度测定
特点
检测只需1微升的样本，适用于极 微量样本的检测。
直接使用加样器将待检测样本加在
检测的表面上，无需使用比色皿和 毛细管。 不浪费样本，节省消耗品费用。 样本无需进行稀释，即可进行快 速、简便的检测，检测范围宽。
操作步骤
在主画面点选“Protein A280”，计算机与仪器自动完成 联机。 先用灭菌水清洗侦测台5-6次，最后一次点“OK”确定。 依照Pro所溶于之液体准备该溶液取出2ul点在侦测台 上，放下上臂后再按“Blank”。 将样品混匀，取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按 “Measure”。
原核表达及蛋白质的纯化
原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。
IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。
加入650mL的去离子水，均匀搅拌。
用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。
9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。
10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。
蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品１. 材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、T ris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。
2. LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5g pH 7.0NaCl 5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
原核表达实验流程
原核表达流程：第一步DH5a感受态制备PCR扩增pGEM-T载体重组载体1 DH5a感受态细胞转化转化细胞1抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性1Pet28a/DH5a载体重组重组载体2第二步重组载体2 DH5a感受态细胞转化转化细胞2抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性3BL21感受态细胞转化细胞3诱导表达蛋白质提取SDS-PAGE电泳检测呈阳性目的蛋白一.感受细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。
为了提高受体菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。
目前主要采用电转化法和CaCl2 法将外源DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2 感受态细胞。
本实验制备的是电转化感受态细胞。
实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
(109～1010转化子/μg DNA)实验材料：LB 培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。
无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。
10％甘油：10ml甘油加入90m l ddH2O水，混匀，高压灭菌。
其他：DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100ml LB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。
实验仪器酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃离心机等。
实验方法(1) 将大肠杆菌DH5a 贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好的平皿放入4℃冰箱贮存备用）。
原核表达及蛋白纯化方法
蛋白原核表达预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。
2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。
3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。
4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。
（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的）5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。
6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL 菌液转入1.5 mL 离心管中，12，000 g 离心2 min，弃上清，加入800 μL 超声波反应缓冲液，15% ，超声1 s ，间隔2 s ，反应5 min ，4 ℃，12，000 g 离心2 min，取500 μL 上清，在上清样品中取40 μL 上清加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品B（可溶性蛋白）。
7. 沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500 μL 裂解缓冲液悬浮沉淀，取40 μL 沉淀，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。
原核表达实验
原核表达实验原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。
实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
c. 10 mg / mL 溶菌酶。
d. 脱氧胆酸。
e. 1 mg / mL DNase I。
2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。
原核表达实验报告
原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。
二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。
三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。
2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。
3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。
6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。
四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。
2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。
3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。
6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。
五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。
这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。
目的基因在原核细胞中的表达
实验八目的基因在原核细胞中的表达一、实验原理（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰氨聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。
常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。
化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。
低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。
（二）诱导表达原理IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。
二、实验用品1.仪器用具：垂直电泳槽、电泳仪、eppendorf管、微量移液器、枪头、微量加样器、25ml烧杯、直径20cm 培养皿、量筒、容量瓶、试剂瓶、单面刀片、蛋白Marker；2.材料试剂：含目的基因表达载体的M15菌株，Amp，Kana，LB液体培养基，SDS、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰氨、Tris、甘氨酸、HCl、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、甘油、溴酚蓝、甲醇、乙酸、NaOH。
3.需配试剂（1）4×Tris.Cl/SDS pH8.8300mlH2O中溶解91gTris碱，用1mol/L HCl调校至pH8.8，补加H2O至整体积为500ml，加入2g SDS，可4℃保存一个月。
原核细胞基因表达调控与产物纯化综合实验设计与教学实践
ＩＳＳＮ１００６－７１６７ＣＮ３１－１７０７／ＴＲＥＳＥＡＲＣＨＡＮＤＥＸＰＬＯＲＡＴＩＯＮＩＮＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ第３９卷第８期 Ｖｏｌ．３９Ｎｏ．８２０２０年８月Ａｕｇ．２０２０ 原核细胞基因表达调控与产物纯化综合实验设计与教学实践李 欣， 赵玉红， 赵立青， 李小菊， 张伟英， 石建党（南开大学生命科学学院生物国家级实验教学示范中心，天津３０００７１）摘 要：为了提升分子生物学实验教学效果和教学质量，课程组设计了“原核细胞基因表达调控与产物纯化综合实验”。
在设定条件下，利用科研常用技术手段对原核细胞目的基因在转录和翻译水平上进行检测，分析启动子利用效率和蛋白表达水平变化情况，并对靶蛋白进行纯化。
结果表明，经过１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导，原核细胞模式生物大肠杆菌在转录水平上启动子活性明显提高，翻译水平上可见目的蛋白表达量显著增加，并最终通过填料法亲和层析获得良好的蛋白纯化效果。
实验通过科学严谨的实验方案以及合理灵活的教学设计，强化了学生对基因表达调控的理解与掌握，拓展了实验教学的广度与深度，进一步推动了分子生物学实验教学的改革和创新。
关键词：基因表达调控；产物纯化；综合实验；教学实践中图分类号：Ｇ６４２．０ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００６－７１６７（２０２０）０８－０１５５－０５ 收稿日期：２０１９ １０ ２５基金项目：２０１９年南开大学自制实验教学仪器设备项目基金（１９ＮＫＺＺＹＱ）；２０１９年南开大学实验教学课程改革项目基金（２０１９ＮＫＳＹＪＧ）；南开大学在线课程建设项目基金（ＮＫＪＧ２０１９０１３）作者简介：李 欣（１９８５－），女，天津人，硕士，实验师，主要从事生物化学和分子生物学实验教学管理工作。
Ｅ ｍａｉｌ：ｓｔｊｋｈｙｘｆ＠１２６．ｃｏｍ通信作者：石建党（１９７２－），男，河南邓州人，博士，副教授，学科方向为类固醇激素作用分子机制。
Ｅ ｍａｉｌ：ｓｈｉｊｄ＠ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＤｅｓｉｇｎａｎｄＴｅａｃｈｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＲｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｄｕｃｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＣｅｌｌｓＬＩＸｉｎ， ＺＨＡＯＹｕｈｏｎｇ， ＺＨＡＯＬｉｑｉｎｇ， ＬＩＸｉａｏｊｕ， ＺＨＡＮＧＷｅｉｙｉｎｇ， ＳＨＩＪｉａｎｄａｎｇ（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｎｔｅｒ，ＣｏｌｌｏｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮａｎｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｔｅａｃｈｉｎｇｅｆｆｅｃｔａｎｄｑｕａｌｉｔｙｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｅａｃｈｉｎｇ，ｔｈｅｎａｔｉｏｎａｌｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｅａｃｈｉｎｇｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎｃｅｎｔｅｒｏｆａｕｔｈｏｒｓ’ｓｃｈｏｏｌｈａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ＂ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ＂．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｔｅｎｔｉｓｔｏｕｓｅｔｈｅｃｏｍｍｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎａｌｙｚｅｔｈｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓ，ａｎｄｐｕｒｉｆｙｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｍｏｄｅｌＥ．ｃｏｌｉａｔｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｔｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ，ａｎｄｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｉｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄｒｉｇｏｒｏｕｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｇｒａｍｓａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅａｎｄｆｌｅｘｉｂｌｅｔｅａｃｈｉｎｇｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃａｎｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｓｔｕｄｅｎｔｓ’ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇａｎｄｍａｓｔｅｒｙｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｄｔｈｅｂｒｅａｄｔｈａｎｄｄｅｐｔｈｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅａｃｈｉｎｇ，ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｒｅｆｏｒｍａｎｄｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅａｃｈｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｐｒｏｄｕｃｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｔｅａｃｈｉｎｇｐｒａｃｔｉｃｅ 第３９卷 ０ 引 言基因表达调控是指生物体内基因表达的调节控制，使细胞中基因表达的过程在时间、空间上处于有序状态，并对环境条件的变化作出反应的复杂过程［１］。
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原核生物分离纯化实验设计
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：
获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测
操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体
1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种
1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Ampr）作筛选，挑取单克隆，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
（四）诱导表达
1、挑取含重组质粒的菌体涂板，挑单克隆至5ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、收菌，离心12000g×30s收获沉淀，每毫升菌液按50ulPBS重悬，加入1%TritonX-100（v/v）,β-巯基乙醇（v/v）。
PMSF（终浓度1mM）；
一下步骤在冰上操作：
5、超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令
其吸附蛋白1h。
6、2000g，3min离心弃上清；
7、加入至少10倍体积的PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000g，3min离心弃上清；
8、重复步骤7两次；
9、加入1mlGST Elution Buffer,轻摇10min；
10、2000g，3min离心，收集上清；重复步骤8--9至少两次；
11、SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度
注：SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。
它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸：蛋白复合物。
在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。
在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。
三、注意事项
1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。
如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。
2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
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表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
一、原理
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备
1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37℃溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10′电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。
7、2′SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤
采用垂直式电泳槽装置
（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
1、分离胶(10%)的配制:
ddH2O 4.0ml
30%储备胶 3.3ml
1.5M Tris-HCl
2.5ml
10% SDS 0.1ml
10% AP 0.1ml
取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
（凝胶完全聚合需30-60min）
2、积层胶（4%）的配制：
ddH2O 1.4 ml
30%储备胶0.33 ml
1M Tris-HCl 0.25 ml
10%SDS 0.02 ml
10%AP 0.02 ml
TEMED 2 μl
将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。
（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
（三）电泳:在电泳槽中加入1′电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。
（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。
（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。
（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、注意事项
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。
室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。