原核表达及纯化总结教学提纲

原核表达及纯化总结

His标签重组蛋白大量表达及纯化

一筛选及鉴定

1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定

表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µL DH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中

↓

冰上放置30min

↓

42℃准确热激90秒

↓

冰上放置3min

↓

加入300µL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h

↓

将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全

吸收后，

在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。

2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下

挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。

PCR扩增体系如下：

取1 μL菌液作为模板

反应体系如下：

模板 1 µL

10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 µL

dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 µL

上游引物（10 µmol/L） 1 µL

下游引物（10 µmol/L） 1 µL

Taq酶（5 U/µL）0.3 µL

ddH2O 13.1µL

Total 20 µL 条件：

94℃预变性 10min

94℃变性 45s

50℃退火 45s

72℃延伸 1min，30个循环的扩增反应

72℃延伸 10 min

4℃∞

1%琼脂糖凝胶电泳检测：

电泳上样时：Marker DL2000上样3µL

样品（1µL loadingbuffer +6µL PCR产物混匀上样）

100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。

（注意：记得保存菌种）

3 阳性克隆质粒抽提

取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min 培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。

质粒抽提方法如下：

取1.5mL菌液于1.5mL离心管中

↓

12000rpm离心30s，弃上清

↓

加800μL STE悬浮沉淀

↓

12000rpm离心30s，弃上清

↓

重复STE漂洗沉淀的过程

↓

加入100μL预冷的solution Ⅰ，强烈振荡混匀

↓

温和加入200μL solution Ⅱ（solution Ⅱ现用现配），盖紧管口快速颠倒5次，

放置冰上2 min至溶液清亮而粘稠

↓

极温和加入150μL预冷的solution Ⅲ，

倒置温和振荡10s，冰上放置5 min

↓

12000rpm离心5 min

↓

取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀

↓

12000rpm离心5 min

↓

取上清（350μL），加入1/10体积（35μL）的NaAc（3M）

和2倍体积预冷的无水乙醇（700μL）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20℃保

存）

↓

室温放置20min（-20℃沉淀效果更好）

13000rpm离心10 min↓

弃上清（小心倒出），用1ml 70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀

↓

13000rpm离心10min

室温放置让乙醇挥发干净

↓

用20μl TE溶解质粒DNA，每20μL体系中加入1μL 1mg/mL的Rnase，37℃作用30min，1%琼脂糖电泳定量检测纯度

所用试剂：

1、STE：0.1mol/L NaCL

10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)

1mmolol/L EDTA

2、solution Ⅰ：50mmolol/L Glucose

25mmolol/L Tris-HCL（pH8.0）

10mmolol/L EDTA(pH8.0)

3、solution Ⅱ： 0.2mol/L NaOH

1%SDS

4、solution Ⅲ：5mol/L KAc 60mL

冰醋酸 11.5mL

无菌水 28.5mL

(最终K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L)

4 BL21的转化及诱导表达

质粒转化BL21感受态细胞方法如下：

取100µL BL21感受态细胞，加入1µL质粒

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冰上放置30min

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42℃准确热激90秒

↓

冰上放置3min

↓

加入900µL无Amp+的LB液体培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h

↓

取100μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全

吸收后，

在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。

5 目的蛋白的诱导表达

挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基（含Amp+）中

180rpm/min，37℃培养。

待菌液浓度OD600≈0.6时开始诱导：

1. 首先取出50µL菌液留样

2. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 3µL

3. 30℃ 180rpm/min 诱导4h收菌

6 目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

1.取700μL菌液13000 rpm离心1min，弃上清

2.空菌对照及marker

3.加30μL PBS和30μL 2×SDS上样缓冲液，用枪吹匀

4.沸水煮10min，稍离心，将液体汇聚管底，取10µL上样

12%的胶浓缩胶90V 10min