原核表达及纯化总结教学提纲
维真生物-原核蛋白的表达、分离和纯化
原核蛋白的表达、分离和纯化实验原理：携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤：一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
模块二 原核表达和纯化 实验报告
模块二原核表达和纯化一、实验目的1、获得最佳的表达条件和纯化方法。
2、学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白技术。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂过硫酸胺，TEMED作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成的网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果更好。
外源基因通过表达载体进入宿主细胞后，会利用宿主的蛋白表达体系表达外源蛋白。
理论上看，只要载体具有良好的表达调控元件，就能成功地表达。
但实际情况不是这么简单。
(1)每次转化获得的菌落，其表达外源蛋白的潜力可能是不一样的。
我们一般认为，同样的质粒和感受态细胞，虽然长出来了不同菌落，但显然它们的遗传物质是一模一样的，所以蛋白表达潜力也应该是一模一样的。
因此认为不同菌落具有不同表达外源蛋白潜力这种说法显然是经验之谈。
可以多挑几个菌落做后续测试。
(2)因此，无论何种条件下外源蛋白表达出来了，接下去的工作是在-70℃冰箱好好地保存菌种。
(3)IPTG是控制外源基因表达的开关，外源蛋白的表达将占用细菌本身的蛋白合成机器和能量，自身的繁殖将减弱。
在更高OD600时诱导，有更高的生物量，通常可以产生更多的外源蛋白。
但IPTG诱导的时间点并非可以无限地延迟，有的细胞在高OD600时诱导可以达到很好的表达的效果，但有的细胞诱导时机一旦OD600 > 0.5，就不表达外源蛋白。
适中的诱导时间点可以设置OD600 = 0.8。
(4)IPTG浓度？通常不是主要因素。
在0.2mM诱导不出的即使加到1mM也不会出来。
(5)诱导时间要进行测试，诱导之后每隔2hr取样检测。
(6)小体积（<200ml）摸索出来的最佳诱导条件，在大体积中（>1L）经常不适用。
所以每次改变系统，通常要重新来过。
(7)当测试完以上条件，还无法表达出蛋白，那么只能重新构建载体，改造外源基因让其更长或更短，还要重新检查外源基因是否有大肠杆菌不喜欢的密码子。
重组蛋氨酸裂解酶原核体系的表达及纯化
Ｔｈｅ Ｅｘｐ ｅ ｓ ｏ ｎｄ Ｐｕ ｉ ｃ ｔ ｏ ｆＲｅ ｏｍ ｂ ｎ ｎ ｅ ｈ ｏ ｉ ｅ ｒ ｓ ｉ ｎ ａ ｒｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｃ ｉ ｉ ａ ｔＭ ｔ ｉ ｎ ｎ
Ｌｙａｓ ｎ ｈｅ Ｐｒ ｅ ｉ ｔ ｏｋａ ｙｏｔ ｃ Ｓｙｓ ｅ ｒ ｉ ｔｍ
４ ℃温度诱 导 ；并对诱导条件进行优化 ，获得大量表达 ；建立蛋氨酸裂解酶纯化体 系．结果 ２
构建 出 Ｍｅ ｓ 基 因 ｔ ａ
的两种高效原核表 达体系 ｐ Ｖ ２一 ｔ ｅ和 ｐ Ｅ 一 Ｔ １Ｍｅ ｓ ，并优化各 自的最佳 诱导表达 条件 ；建立 重组蛋 Ｂ ２ ０ Ｍｅ ｓ ａ Ｇ Ｘ ４一一 ｔ ｅ ａ
ＨＵ ｅ Ｚｈ ｎ—ｌａ ｉｎｇ， ＺＨＡＮＧ ｎ Ｆａ ｇ，ＴＩ ＡＮ Ｌａ—ｍｅ ， ＲＥＮ ａ ｉ Ｘｉｏ—ｌ， ＴＩ ｉ ＡＮ Ｃｈａ ｇ—ｆ ｎ ｕ
（ｒｔｉ ｎ ｉｅ ｒ ｇＲ ｓａｃ ｅ ｔｒ ｉ ｄｃｌ ｎ ｎ ｅｉ ｅｅｒｈＣ ｎｅ ，Ｋ ｎ ｎ ｄｃｌ Ｐｏｅｎ Ｅ ｇｎ ｅｉ ｅｅ ｒｈＣ ｎｅ ，Ｂ ｏ ｉ ｇ ｅｒ ｇＲ ｓａ ｅ ｔｒ ｕ ｍｉ Ｍｅ ｉａ ｓ ｎ ｍｅ ａ Ｅ ｉ ｎ ｃ ｇ Ｕ ｉ ｒｉ ，Ｋｕ ｍ ｎ ｕ ｎ ｎ６ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｎｖ ｓ ｙ ｅ ｔ ｎ ｉｇＹ ｎ ａ ５ ５ ０ ｈｎ ）
（ 昆明 医科 大学生物 医学工程 研 究 中心 ，基 因与蛋 白质 工程研 究室 ，云 南 昆 明 ６ ０ ０ ） ５ ５ ０
［ 摘要］ 目的 建立 Ｌ 一蛋氨酸 ＾一裂解 酶的原核表达 、纯化体系． 方法 ｙ 合成 Ｍ ｔｓ 基 因并 构建重组质粒 ｅａｅ
ｐ Ｓ － ￣ｅ Ｂ Ｋ Ｍｅ ｓ．通过分 子克 隆技 术 ，构建 重组 表达质粒 ｐ Ｖ ２ 一 ｔ ｅ和 ｐ Ｅ 一 Ｔ １ Ｍｅ ｓ，并将重组子转化 到 Ｂ ２ ０ Ｍｅ ｓ ａ Ｇ Ｘ ４ 一一 ｔ ｅ ａ 感受态大肠杆菌 Ｄ ５ 中．ｐ Ｅ 一 Ｔ １ Ｍ ｔｓ 经异丙基 一ｐ— 一硫代半乳糖苷 （ Ｔ ）诱导 ；ｐ Ｖ ２ 一 ｔ ｅ ｈ仅 Ｇ Ｘ ４ 一 一 ｅａｅ Ｄ Ｉ Ｇ Ｐ Ｂ ２ ０ Ｍｅ ｓ 经 ａ
原核表达总结
原核表达之目的基因克隆1.了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。
还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。
稀有密码子预测网址：.ru/eng/scripts/01_11.html/~mmaduro/codonusage/usage.htm/RACC//~sumchan/caltor.html原核表达蛋白可溶性预测网址：/综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。
注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。
一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。
2.搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。
《原核表达实验》课件
克隆表达载体
选择合适的表达载体，根据载体和目标基因序列的特点进行克隆操作。注意 避免操作中可能发生的错误。
转化表达宿主菌
根据实验要求选择适当的表达宿主菌，通过化学方法、热激转化等方式将表 达载体导入宿主菌中，并对转化结果进行鉴定。
培养表达
根据所选宿主菌的特性和表达需求，进行培养条件的优化。添加适当的诱导 剂，控制表达过ห้องสมุดไป่ตู้的时机和水平。
《原核表达实验》PPT课 件
原核表达实验PPT课件
简介
原核表达实验是一种常用的生物学实验方法，用于在原核生物中大量表达蛋 白质。通过本课程，了解原核表达实验的重要性和应用。
实验流程
1
克隆表达载体
2
选择合适的表达载体，并进行克隆操作，
确保载体和目标基因的正确组装。
3
培养表达
4
在适当的培养条件下，添加诱导剂，使
宿主菌表达目标蛋白质。
5
制备DNA模板
从适当来源获取DNA模板，构建表达载体， 为实验做好准备。
转化表达宿主菌
选择合适的表达宿主菌，通过转化方法 将表达载体导入宿主菌中。
纯化蛋白质
根据需要选择合适的方法进行蛋白质纯 化，以获取高纯度的目标蛋白质。
制备DNA模板
DNA模板的来源包括基因库、PCR产物等。构建表达载体，并根据实验需要制备适量的DNA模板，为后续实验 做好准备。
纯化蛋白质
根据目标蛋白质的特性和实验要求，选择适当的纯化方法，例如亲和层析、离子交换层析等，保证纯度和活性。
结论
通过学习原核表达实验，我们可以更好地理解蛋白质的结构和功能，并为未来的科研工作提供有力的支持。 总结原核表达实验的优缺点，展望其在未来科学研究中的应用前景。
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
第九章原核表达总结
调控机制 （负调控）
Lac操纵子诱导剂
生理性诱导剂 实验常用诱导剂
乳糖，别位乳糖 异丙基硫代半乳糖 （IPTG）
安慰诱导物（IPTG） ：
有极强的诱导效应，而本身不被分解。
No lactose:repressor
LacI
Promoter mRNA
Operator
Repressor monomer
高Trp时： 阻遏物+Trp 结合操纵基因
阻遏物
活化的 阻遏蛋白
(Trp)
图 16-27 TrpR 被 Trp 激活后可阻遏 trp 操纵子的转录 (仿 B.Lewin:《GENES》Ⅳ，1990, Fig .13.16)
色氨酸的调节
调节区
trpR
转录衰减
结构基因
RNA聚合酶 P O RNA聚合酶
分解底物的酶只有在底物存在时才出现。
无乳糖： 有乳糖： 〈５个分子的半乳糖苷酶 ５０００个半乳糖苷酶分子 ／２－３分钟 ５％－１０％（蛋白总量）
有的酶可被诱导
乳糖操纵子的调控机制
1. 乳糖操纵子的负调控 2. 乳糖操纵子的正调控： cAMP-CAP的调控作用
3.乳糖操纵子的协调调控
乳糖操纵子的负调控
第七章 原核生物 基因的表达与调控
授 课 内 容
相关基本概念 乳糖操纵子模型及调控机制 色氨酸操纵子模型及调控机制 翻译水平的调控 真核生物的调控
重点： 乳糖、色氨酸操纵子调控的机制
难点： 阻遏蛋白与诱导物操作子的相互作用 cAMP-CAP的正调控作用
原核生物基因表达的调控
1、基因表达的多级调控
转录衰减机制
前导DNA
RNA聚合酶
蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品１. 材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、T ris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。
2. LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5g pH 7.0NaCl 5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定
记录测定结果。
用灭菌水清洗侦测台5-6次，退出系统，关闭计算机。
防止二价Ni被还原。
不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失。 建议在破碎细胞的时加入蛋白酶抑制剂，如0.11mM的PMSF，防止目的蛋白被降解。
缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水
相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）。 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间。 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween等，最 高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。
GST标签蛋白的纯化
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm 离心1min集菌，然后用 PBS洗涤诱导后的菌体2-3次，Buffer A（一般用1/10体 积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm离心 20min取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的 Glutathione Sepharose 4B，室温摇床轻轻晃动作用1h，使 蛋白充分吸附。 • 2000 rpm离心5min，弃上清。 • 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B 悬浮于溶液中，2000rpm离心5min弃上清。 • 重复上步两次。
蛋白浓度测定
特点
检测只需1微升的样本，适用于极 微量样本的检测。
直接使用加样器将待检测样本加在
检测的表面上，无需使用比色皿和 毛细管。 不浪费样本，节省消耗品费用。 样本无需进行稀释，即可进行快 速、简便的检测，检测范围宽。
操作步骤
在主画面点选“Protein A280”，计算机与仪器自动完成 联机。 先用灭菌水清洗侦测台5-6次，最后一次点“OK”确定。 依照Pro所溶于之液体准备该溶液取出2ul点在侦测台 上，放下上臂后再按“Blank”。 将样品混匀，取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按 “Measure”。
原核表达及蛋白质的纯化
原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。
IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。
加入650mL的去离子水，均匀搅拌。
用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。
9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。
10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。
马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化
ｅ ｐ ｅ ｓｄ ｐｏ ｅｎ ｗａ ｕ ｆ ｄｕ ｉｇＨｉ－ ｎ ＋ ａ ｎｔ ｈ ｏ ｔ ｇａ ｈ ｄｉ ｅ ｔ ｅ ｙ Ｗｅｔｒ ｌｔ Ｒ翻ｕ ｅｒｃ ｍｂｎ ｔ ｘ ｒｓｅ ｒ ｔｉ ｓｐ ｒｉ ｓｎ ｓＢａ ｄＮｉ ｆ ｉ ｃ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ ａ ｄ ｎ ｆ ｄ ｂ ｓｅｎｂ ｏ． ｉ ｅ ｉ ｙ ｎ ｉ ｉ ｈ Ｔｈ ｅ ｏ ｉ ａ ｎ
中国动物检疫 ２ １ 年第 ２ 卷第 １ 期 ０１ ８ Ｏ
— ５— — — ３
马 尔堡病毒核 蛋 白的原核表 达及纯化
王 皓婷 ， 水 明 ， 子学 ， 王 史 邵东 华 ， 建超 刘 学辉 王志 亮 ， 魏 ， ， 王雪敏 ， 马志 永
（． １ 中国农业科 学院上海兽 医研究所兽 医公共卫生研究室， 上海 ２ ０４ ：２ 河北工程 大学农 学院， ０２ １ ． 河北 邯郸 ０６ ０ ；３ 南京出入境检验检疫局 ， ５０１ ． 江苏 南京 ２ １０ ；４ 中国动物卫生与流行病学中心， １１６ ． 山东 青岛 ２ ６ １ ） ６ １４
Ｓ ａ ｇ ａ，２ ０ ４ ，Ｃ ｉａ ． ｏ ｅｅ ｆ ｇ ｃ ｌ ｒ，Ｈｅ ｅｕ ｉｅｓｙｏ ｇｎ ｅ ｎ ，Ｈａ ｄｎ ｈｎ ｈ ｉ ０ ２ １ ｈｎ ；２ Ｃ Ｈ ｇ Ａ ｒ ｕｔ ｅ ｏ ｉ ｕ ｂ ｉ ｎｖ ｒｔ ｆ ｎ ｉｅｒ ｇ ｎ ａ ，Ｈｅ ｅ，０ ６０ ，Ｃ ｉａ ．ｎｊ ｇ ｉ ｅ ｉ ｂ ｉ ５ ０ １ ｈｎ ；３ Ｎａ ｉ ｎ Ｅ ｔ －ｘｔｎｐ ｃ ｏ ｄＱｕｒ ｔ ｅ ｕｅｕ ｎｊ ｇ ｉ ｇｕ １ １６ ｈｎ ；４Ｃ ｉａ ｎｍａ Ｈ ａｔ ｎ ｐｄｍｉｌｇ ｅ ｔ ， ｎｒ Ｅ ｉＩｓｅｔ ｎａ ａａｉ ｒａ ，Ｎａ ｉ ，Ｊ ｓ ，２ １０ ，Ｃ ｉａ ．ｈｎ Ａ ｉ ｌ ｅ ｌ ａｄＥ ｉｅ ｏｏ ｙＣ ｎｅ ｙ ｉ ｎ ｎ ｎＢ ｎ ｎ ａ ｈ ｒ
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。
本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。
一( 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达制样 (一)1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Ampo(100mg/mL)，37C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1:50比例(200ul)，将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，o加入10uLAmp(100mg/ml)，37C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。
(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK)，其余ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l)，使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。
7ml菌液加入7o以200r/min的转速，37C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。
5. 加入1ml dHO，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，2倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离心管中的水倒干净。
(二)菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。
用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100?恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。
原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。
然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。
为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。
其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。
镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。
通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。
在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。
然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。
接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。
最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。
镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。
通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。
然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。
综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。
随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。
文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。
原核表达实验报告
原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。
二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。
三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。
2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。
3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。
6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。
四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。
2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。
3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。
6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。
五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。
这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。
原核表达及纯化总结
His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µL DH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h↓将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。
2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。
PCR扩增体系如下：取1 μL菌液作为模板反应体系如下：模板 1 µL10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 µLdNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 µL上游引物（10 µmol/L） 1 µL下游引物（10 µmol/L） 1 µLTaq酶（5 U/µL）0.3 µLddH2O 13.1µLTotal 20 µL 条件：94℃预变性10min94℃变性45s50℃退火45s72℃延伸1min，30个循环的扩增反应72℃延伸10 min4℃∞1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3µL样品（1µL loadingbuffer +6µL PCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。
（注意：记得保存菌种）3 阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。
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原核表达及纯化总结His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µL DH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h↓将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。
2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。
PCR扩增体系如下：取1 μL菌液作为模板反应体系如下：模板 1 µL10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 µLdNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 µL上游引物（10 µmol/L） 1 µL下游引物（10 µmol/L） 1 µLTaq酶（5 U/µL）0.3 µLddH2O 13.1µLTotal 20 µL 条件：94℃预变性 10min94℃变性 45s50℃退火 45s72℃延伸 1min，30个循环的扩增反应72℃延伸 10 min4℃∞1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3µL样品（1µL loadingbuffer +6µL PCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。
（注意：记得保存菌种）3 阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min 培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。
质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中↓12000rpm离心30s，弃上清↓加800μL STE悬浮沉淀↓12000rpm离心30s，弃上清↓重复STE漂洗沉淀的过程↓加入100μL预冷的solution Ⅰ，强烈振荡混匀↓温和加入200μL solution Ⅱ（solution Ⅱ现用现配），盖紧管口快速颠倒5次，放置冰上2 min至溶液清亮而粘稠↓极温和加入150μL预冷的solution Ⅲ，倒置温和振荡10s，冰上放置5 min↓12000rpm离心5 min↓取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀↓12000rpm离心5 min↓取上清（350μL），加入1/10体积（35μL）的NaAc（3M）和2倍体积预冷的无水乙醇（700μL）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20℃保存）↓室温放置20min（-20℃沉淀效果更好）13000rpm离心10 min↓弃上清（小心倒出），用1ml 70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀↓13000rpm离心10min室温放置让乙醇挥发干净↓用20μl TE溶解质粒DNA，每20μL体系中加入1μL 1mg/mL的Rnase，37℃作用30min，1%琼脂糖电泳定量检测纯度所用试剂：1、STE：0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)1mmolol/L EDTA2、solution Ⅰ：50mmolol/L Glucose25mmolol/L Tris-HCL（pH8.0）10mmolol/L EDTA(pH8.0)3、solution Ⅱ： 0.2mol/L NaOH1%SDS4、solution Ⅲ：5mol/L KAc 60mL冰醋酸 11.5mL无菌水 28.5mL(最终K+的浓度为3mol/L，Ac-的浓度为5mol/L)4 BL21的转化及诱导表达质粒转化BL21感受态细胞方法如下：取100µL BL21感受态细胞，加入1µL质粒↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入900µL无Amp+的LB液体培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h↓取100μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。
5 目的蛋白的诱导表达挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基（含Amp+）中180rpm/min，37℃培养。
待菌液浓度OD600≈0.6时开始诱导：1. 首先取出50µL菌液留样2. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 3µL3. 30℃ 180rpm/min 诱导4h收菌6 目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定1.取700μL菌液13000 rpm离心1min，弃上清2.空菌对照及marker3.加30μL PBS和30μL 2×SDS上样缓冲液，用枪吹匀4.沸水煮10min，稍离心，将液体汇聚管底，取10µL上样12%的胶浓缩胶90V 10min分离胶160V 50min考马斯亮蓝染色 30min脱色液脱色二大量诱导表达1．取300μL菌液，加入到50mL LB液体培养基（含Amp+）中 180 rpm/min 37℃过夜2．将50ml菌液全部加入到500ml LB液体培养基（含Amp+）中 200rpm/min，37℃，大约2h左右，此时OD600约等于0.6开始诱导3. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 550μL诱导条件：30℃ 180rpm/min诱导时间：4h收菌（取700μL留样电泳分析，是否表达出来及表达位置和表达量）三细胞裂解1.将550ml菌液，收菌前准确称出瓶中（为计算湿菌重量）2.分三次，4800 rpm/min离心20min，在用PBS洗涤一次，倒置用滤纸控干3.称全重，计算出湿菌重量4.每克湿菌加5ml Lysis buffer（Tris：50mM Nacl：300mM PH:8.0）混匀转移到50ml管内5.每毫升菌液加1:500加0.1M PMSF6.加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶E，玻棒搅动20min7.-80 ℃反复冻融3-5次（冰水混合物中融化）8.每克湿菌加4mg脱氧胆酸（脱氧胆酸先用1ml Lysis buffer溶解），取样30μL准备电泳分析（玻璃棒37℃水浴中搅拌30min，此步骤若是不可溶性蛋白可这样处理，若是可容性蛋白可在冰水混合物中搅拌）9.用注射器在冰水混合物中反复吹吸，使菌液不再成团，变得更加粘稠10.超声20min（每次超声不得超过30s）11.加终浓度5μg/ml的DNaseⅠ和RNase A及终浓度10mM 的CaCl2和MgCl212.室温摇床作用30min，注射器反复吹吸13.补加一倍体积的Lysis Buffer，同时加终浓度为1%的曲拉通。
（平时常温曲拉通储存液浓度为20%，否则不宜溶解）14.反复吹吸15.13000rpm/min 20min16.上清补加PMSF(1:500) 沉淀用bufferB 溶解同样补加PMSF(1:500)Buffer B： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:8.0Buffer C: NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:6.8（不含咪唑，咪唑现用现加，终浓度10 mM）咪唑2M（2M咪唑分装-20℃保存）Buffer D： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:8.0(咪唑终浓度100mM)分析：上清及沉淀还有样品处理前的留样，进行电泳分析鉴定目的蛋白是可溶的还是不可溶的以便选择纯化方式四 His标签蛋白纯化（可溶和不可溶性）可溶性蛋白纯化（上样前要将上清过0.22μm的滤膜）1）wash buffer 平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minwash buffer：NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:6.8 过滤0.22μm除气2）上样流速0.3ml/min（注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流穿液，（取样电泳）流穿液也再过一次柱子，接二次流穿液，留样电泳一般可溶性蛋白：过一次柱子就可以将目的蛋白完全吸附，这与柱子有一定关系，第一次操作，最好将一次流穿液再过一便柱子。
3） wash buffer（含20mM咪唑）洗脱杂蛋白 0.8ml/min，洗脱至少100ml，直到蛋白吸收曲线变平为止（取30μL 电泳分析）4） Elution buffer 洗脱目的蛋白（含250mM咪唑）Elution buffer：NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:8.0过滤0.22μm除气流速0.3ml/min 收集蛋白收集峰值每管2ml5）wash buffer 平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/min6）保存柱子时用20%酒精，4℃7）对纯化的样品电泳分析纯度，紫外分光度法定量蛋白浓度（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260蛋白1:1000分别加入：0.1M PMSF0.5M EDTA 100× PH:7.5（即储存液为100×，加入终浓度为1×）5M L-Arginine 100× PH:7.5（即储存液为100×，加入终浓度为1×）分装-20℃保存不可溶性蛋白纯化1）沉淀用30ml buffer B溶解后，13000rpm 离心15min 上清过0.22μm的滤膜2）Buffer B平衡柱子（不含咪唑）流速1ml/minBuffer B NaH2PO4 20mM；Nacl 500mM；Urea 8M；PH:8.03）上样流速0.3ml/min（注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流穿液，（取样电泳）流穿液重复3-4次过柱子每次的流穿液都要留样电泳分析不可溶性蛋白一般浓度较高，一次不能让柱子充分吸附，所以流穿液重复上样4）Buffer C洗脱杂蛋白，流速0.8ml/min，洗脱至少100ml，直到蛋白吸收曲线变平为止，可用考马斯亮蓝G-250 监测Buffer C NaH2PO4 20mM；Nacl 500 mM；Urea 8M；PH:6.8（含咪唑终浓度10 mM），一般咪唑现用现加，配好的2M咪唑分装-20℃保存5）Buffer D洗脱目的蛋白（含100mM咪唑）流速0.3ml/minBuffer D：NaH2PO4 20mM；Nacl 500 mM；Urea 8M；PH:8.0(咪唑终浓度为100mM)6）收集目的蛋白，收集峰值，2ml/管7）蛋白跑电泳分析，含目的蛋白的管子合在一起，透析复性。