多重不对称扩增介绍 共19页PPT资料
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PCR技术的原理及其应用ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
最新课件
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
最新课件
3
1.PCR技术的基本原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
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14
锚定PCR原理示意图
最新课件
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用 同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶 基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标 记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
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16
不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物， PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制 引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应 的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当 限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引 物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键 是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比 例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链 DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行 第二次PCR，制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA， 主要用于核酸序列测定。
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9
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
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1.PCR技术的基本原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用 同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶 基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标 记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
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16
不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物， PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制 引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应 的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当 限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引 物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键 是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比 例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链 DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行 第二次PCR，制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA， 主要用于核酸序列测定。
MDA 多重置换扩增技术ppt课件
学习交流PPT
18
• SNPs和STRs基因型检测 • 基因拷贝数改变的检测 • DNA测序
总的来说，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖 率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA方法。MDA 已经广泛的应用于包括定量PCR、SNP基因型分 析、Southern印迹分析、染色体图谱中。
多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展
基因测序技术
• 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提出 的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法 这两种基本思想。
• 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。
• 基于MDA的单细胞测序 • 主要研发人：深圳华大基因研究院 • 技术看点：将多重置换扩增(MDA)和测序技术相结合。 • 技术简介： • 本技术基于多重置换扩增(MDA)，并对该方法的扩增均一性、灵敏度、特异性等方面进行了全面
评估。这种将多重置换扩增和测序技术相结合的单细胞测序方法不仅具有更高的分辨率和基因组 覆盖度，而且具有更好的敏感性和特异性。该方法从单核苷酸水平上为各种复杂疾病和生物学过 程的研究开辟了新思路。
• 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极 大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。
• 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序 （SMS）
• 多重置换扩增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998年 由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链 置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA。 该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb 的 DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’ -5’外切酶活性， 错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以 保证扩增的高保真性。
不对称PCR
目前，整个细胞生物学领域中所用的原
材料正变得越来越小，尤其是PCR。这有 许多优势，但在对称PCR中，则会带来许 多问题。如果必须采用更多的循环达到Ct，
引物错配及扩增的废物就会增加，这些不
需要的产物会与目标扩增物相竞争，会破 坏试验结果。在对称PCR中，需要花费大
量的时间去优化反应，才能解决这个问题。 LATE-PCR设计了高度特意性引物，Elixirs 使得反应更快更容易进行。采用PurAmp方 法，可以利用单细胞中少量的DNA和RNA 分子进行反应。
不对称PCR
制作人：张天夫
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由
高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构
成： 即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变 性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情 况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模 板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下， 以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA
模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就
成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产 生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两 条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR 产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后， 理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～ 107倍。
产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不 同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。
全自动PCR仪 :
新发展：
由Brandeis 大学Wangh与他人合作发 明的指数线性PCR （LATE-PCR）是一种 新技术，属于不对称PCR的高级形式，在 引物设计时进行革新，并且采用了一种改 良的热循环，可以完成可靠的不对称放大。 如果产生单链，在反应过程中就会累积下 来，因此在退火期间，不需要探针就可以 获得结果。
各种PCR介绍
PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳
PCR 产物
PCR 产物
PCR 技术的应用
1. 基础研究
(1) 基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核 苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。
(2) 基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。
2. 医学
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应 (PCR)，使用两对（而非一对）PCR引 物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩 增片段和普通PCR相似。第二对引物称 为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩 增片段的内部）结合在第一次PCR产物 内部，使得第二次PCR扩增片断短于第 一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果 第一次扩增产生了错误片断，则第二次 能在错误片段上进行引物配对并扩增的 概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常 特异 。
• 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接 已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA 进行分子克隆，建立全长的DNA探针。
1. 用一种在靶序列上没有 切点的限制性内切酶 消化 大分子量的DNA 2. 产生的大小不同的线性 DNA片段群体，其中具靶DNA 区段的DNA分子长度不超过 2-3Kb,经连接后环化成环状 分子
mRNA 5’
1st cDNA 3’
5' 3'
5’ 3’
特异 PCR 产物
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
RT-PCR 原理
AAAAA 3’
3’
5’
逆转录酶、下游引物、dNTPs
5’
Taq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs
3’ 5’
经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝
多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)
HAYS
MLPA技术最早由荷兰学者 Dr . Schouten JP于 2002年提出 ,是一种高通 量、 针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术 ,它利用简 单的杂合 ( hydriation)、 连接 ( ligation)及 PCR扩增 ( PCR amplication)反 应 ,于单一反应管內可同时检测 40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。
长探针长约60-450 bp，包括一个位于其5' 末端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位 于其3' 末端23 nt 的共同序列及两序列间的长度特异填充片段，其共同序列与未标记的PCR 引物相互补。
由于填充片段长短不一而可以区分不同的探针。连接后探针长度在130nt-480nt 之间，相 邻两探针相差6-9 nt。因此可同时检测基因组多达 40种不同靶基因。
该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针 ,而不是扩增样本靶序列。 扩增环节仅需 2条引物一是标记的引物 Y,另一是未标记的引物 X。
PCR 反应以连接的探针为模板由一对通用引物进行扩增。
在所有的短探针的 5‘ 端均有一段 19 nt的共同序列 ,该序列与标记的引物Y的核酸序 列相同;在所有长探针的 3‘ 端均有一段 25～43 nt的共同序列 ,该序列与未标记的引 物 X的核酸序列互补。因此 ,所有连接探针的 PCR扩增所用的是同一对引物。若两探 针连接 ,则扩增可进行;若两探针未连接 ,则扩增无法进行。
针对每个待测基因靶序列设计了一对探针，这一对探针包括一条经化 学合成的短探针（5' 端探针）和一条经M13 噬菌体衍生法制备而来的 长探针（3' 端探针）。
短探针长约50-60 bp，包括一个位于其3' 端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位于其 5' 末端19 nt 的共同序列，该共同序列与标记的PCR 引物相同。
MLPA技术最早由荷兰学者 Dr . Schouten JP于 2002年提出 ,是一种高通 量、 针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术 ,它利用简 单的杂合 ( hydriation)、 连接 ( ligation)及 PCR扩增 ( PCR amplication)反 应 ,于单一反应管內可同时检测 40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。
长探针长约60-450 bp，包括一个位于其5' 末端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位 于其3' 末端23 nt 的共同序列及两序列间的长度特异填充片段，其共同序列与未标记的PCR 引物相互补。
由于填充片段长短不一而可以区分不同的探针。连接后探针长度在130nt-480nt 之间，相 邻两探针相差6-9 nt。因此可同时检测基因组多达 40种不同靶基因。
该技术的特色之一是仅扩增连接完好的探针 ,而不是扩增样本靶序列。 扩增环节仅需 2条引物一是标记的引物 Y,另一是未标记的引物 X。
PCR 反应以连接的探针为模板由一对通用引物进行扩增。
在所有的短探针的 5‘ 端均有一段 19 nt的共同序列 ,该序列与标记的引物Y的核酸序 列相同;在所有长探针的 3‘ 端均有一段 25～43 nt的共同序列 ,该序列与未标记的引 物 X的核酸序列互补。因此 ,所有连接探针的 PCR扩增所用的是同一对引物。若两探 针连接 ,则扩增可进行;若两探针未连接 ,则扩增无法进行。
针对每个待测基因靶序列设计了一对探针，这一对探针包括一条经化 学合成的短探针（5' 端探针）和一条经M13 噬菌体衍生法制备而来的 长探针（3' 端探针）。
短探针长约50-60 bp，包括一个位于其3' 端幵与靶序列完全互补的杂交序列和一个位于其 5' 末端19 nt 的共同序列，该共同序列与标记的PCR 引物相同。
PCR原理ppt课件
1. 长片段DNA的PCR扩增 常规PCR长度为2kb以下。 长片段PCR扩增存在的问题： （1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低 （2）高温会损坏模板DNA和PCR产物 （3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解 （4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用
--人类基因组学
--分子细胞遗传学 --肿瘤诊断学
多重连接探针扩增技术原理
1. 变性 & 2 杂交 PCR 上游引物
5’ 3’ 目标序列 A X 5’ Y 3’ 目标序列 A 5’ 3’ 5’ Y 目标序列 B 5’ 5’
5’
PCR 下游引物 间隔序列 (对于不同探针长短不同) 杂交序列
5’ 3’ 目标序列 B X 5’
3000
2000
5 0 00 13 0 0 0
0
30000
100
150
200
250 S iz e ( n t )
300
350
400
450
25000
TE, 94 oC.
20000
15000
10000
5000
0 100 150 200 250 S ize ( n t) 300 350 400 450
9000
BsmI
“Stuffer” sequence
• 经EcoRV and BsmI酶切后, 可以获得85440 nt长的探针序列.
Hybridising sequence PCR primer sequence
MLPA 工作原理特点
1、检测对象为和两条MLPA探针完全配对的样品DNA序列； 2、扩增对象是杂交在样品上的两条探针由连接酶进行连接之后的产物； 3、不同基因的连接产物长度不同； 4、多重的连接产物能够被同一对引物扩增；PCR具有高度的同步性； 5、扩增产物（大小一般为130-500nt)用于毛细管电泳分析； 6、基因拷贝数变化直接体现在毛细管电泳结果的峰面积差异；
多重连接探针扩增技术 及其应用
深圳市天大生物医疗器械 有限公司
实验五PCR扩增PPT课件
仪器误差
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。
多重不对称扩增介绍-PPT资料19页
2、LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential PCR)
多重不对称PCR重要影响因素
引物二聚体 引物特异性
主要是导致不对称PCR限制性引物和非限制性引 物比例的改变，或者限制性引物绝对量的改变， 从而导致扩增差异化或者扩增失败。
多重不对称PCR设计软件
PrimerPlex（付费）——一款设计特征寡核苷酸 片断、用于同时分析100种核酸序列的工具。
将所有引物并 入一贯体系进 行实验验证
每对引物进行 单扩并验证不 对称扩增引物
最佳比例
谢谢
更多精品资源请访问
docin/sanshengshiyuan doc88/sanshenglu
病原体检测需要更详尽
的PCR设计和优化。
不对称PCR设计
设计不对称PCR引物时，限制性引物的Tm值较非限 制性引物Tm值高4~6°，扩增效果更佳。
不对称PCR设计在于控制限制性引物（低浓度引物） 的绝对量，限制性引物过多或过少，均不利于 SSDNA的制备。限制性引物量可以考虑设置在0.81.5P之间。
不对称PCR
用不等量的一对引物进行模板的扩增，PCR扩增后产生 大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制性引物和限 制性引物。
在扩增过程前10-20个循环，其扩增产物主要是双链DNA， 但当限制性引物(低浓度引物)消耗殆尽，不再引导扩增， 而非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR会继续进行，从 而就会产生大量的单链DNA。
经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时 检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经 费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
多重PCR技术难点
反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相 同.
多重不对称PCR重要影响因素
引物二聚体 引物特异性
主要是导致不对称PCR限制性引物和非限制性引 物比例的改变，或者限制性引物绝对量的改变， 从而导致扩增差异化或者扩增失败。
多重不对称PCR设计软件
PrimerPlex（付费）——一款设计特征寡核苷酸 片断、用于同时分析100种核酸序列的工具。
将所有引物并 入一贯体系进 行实验验证
每对引物进行 单扩并验证不 对称扩增引物
最佳比例
谢谢
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病原体检测需要更详尽
的PCR设计和优化。
不对称PCR设计
设计不对称PCR引物时，限制性引物的Tm值较非限 制性引物Tm值高4~6°，扩增效果更佳。
不对称PCR设计在于控制限制性引物（低浓度引物） 的绝对量，限制性引物过多或过少，均不利于 SSDNA的制备。限制性引物量可以考虑设置在0.81.5P之间。
不对称PCR
用不等量的一对引物进行模板的扩增，PCR扩增后产生 大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制性引物和限 制性引物。
在扩增过程前10-20个循环，其扩增产物主要是双链DNA， 但当限制性引物(低浓度引物)消耗殆尽，不再引导扩增， 而非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR会继续进行，从 而就会产生大量的单链DNA。
经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时 检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经 费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
多重PCR技术难点
反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相 同.
MDA 多重置换扩增技术PPT学习幻灯片
• WGA技术发展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR )、 LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCR．T-PCR)、扩增前引物延伸(primer extension preamplification， PEP)和简并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR， DOP-PCR)。但是，由于发生非特异性扩增，位点覆盖不完全，DNA 产物片段小于1 kb等缺点，限制了这些方法的应用。
10
多重置换扩增技术（MDA）
• 多重置换扩增（multiple displacement amplification，ห้องสมุดไป่ตู้DA）的 技术： 不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA 获得作为模板所需的微克DNA 。
• 整个实验包括： 环境样品的准备、单细胞分离、MDA扩增DNA、DNA测序等。
1多重置换扩增多重置换扩增mda技术对单技术对单细胞基因组测序技术研究进展细胞基因组测序技术研究进展北大肿瘤医院病因学教研室山东省千佛山医院田源基因测序技术基因测序技术目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两种
多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展
1
基因测序技术
• 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提 出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解 法这两种基本思想。
• 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。
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多重置换扩增技术（MDA）
• 多重置换扩增（multiple displacement amplification，ห้องสมุดไป่ตู้DA）的 技术： 不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA 获得作为模板所需的微克DNA 。
• 整个实验包括： 环境样品的准备、单细胞分离、MDA扩增DNA、DNA测序等。
1多重置换扩增多重置换扩增mda技术对单技术对单细胞基因组测序技术研究进展细胞基因组测序技术研究进展北大肿瘤医院病因学教研室山东省千佛山医院田源基因测序技术基因测序技术目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两种
多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展
1
基因测序技术
• 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提 出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解 法这两种基本思想。
• 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。
实验七 PCR扩增技术
【实验试剂】
• • • • • • • • DNA模板; Taq酶，扩增缓冲液，ddH2O; 琼脂糖N; DNA分子量标准; 50TAE电泳缓冲液(储存液); 6*loading buffer; 溴化乙锭溶液(EB)：0.5 mg/ml；管里按以下比例配置50 l反应 体系： • 模板DNA0.5 l • 上游引物1 l • 下游引物1 l • 10扩增缓冲液5 l • dNTP4 l • Taq酶0.5 l • ddH2O38 l
【注意事项】
• • PCR反应灵敏度很高，为了防止污染，使用的 0.2 ml的PCR薄壁管和吸头都应该是无污染的。 加试剂前，应短暂离心10 s，然后再打开试剂的 管盖，以防止污染试剂。 配置PCR反应体系时，Taq酶应该最后加入。使 用工具酶的操作必须在冰浴的条件下进行，使 用后应立即将工具酶放回冰箱。
• 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。 需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 • 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度 是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易 弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问 题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低 效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引 物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要 注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物 条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如 一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有 可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条 引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡 其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多 次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降 解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够， 引物之间形成二聚体等。
孙宝发-使用多重置换扩增(MDA)技术对单细胞基因组进行测序p
单细胞测序与宏基因组的数据相结合，将成为一种将单细 胞测序指导结合多物种的鸟枪测序纳入到单个基因组中的 强大工具。
利用单细胞方法在人类的生物群落中发现新型微生物现 正被一些实验室提出。 对于传染病的研究，它将有可能用 来确定从临床标本中无选择性偏好的培养方法中遗传变异 的病原菌。从单细胞获得的遗传连锁的致病因素和其他基 因与从宏基因组数据获得的全基因组频率相对应。或许， 全环境基因组的方法的可能的最大挑战是巨大的遗传多样 性，即使在相同株的成员间也存在。 到此为止，单细胞测序将对揭示多样性的程度和性质， 种的本质核心或一致基因，自然演变中水平基因转移的作 用，环境因素与多样性关系等方面起重要作用。最后，为 实现更完整的有代表性的基因组的目标，MDA反应酶学的 改进还在继续进行。
背景知识
MDA是最近几年发展起来的一种全基因组扩 增技术,它采用具有高度延伸活性的DNA聚合 酶和耐核酸外切酶的随机引物在等温条件下 对基因组进行扩增的方法,这种方法是以链置 换为基础,最初被用于扩增巨大的环状DNA如 质粒和噬菌体DNA,现在也被用于线型DNA的 扩增,它能对全基因组进行高保真的均匀扩增, 扩增出10～100 kb大小的片段,能提供大量均 一完整的全基因组序列。
即使单一细胞的部分序列也可以大大的推动 生物学研究： 一个单细胞测序的序列草图估计可以覆盖 Beggiatoa spp基因组的70％，这种细菌为一 种至今尚未成功培养的海洋细菌。 预测基因被用来确定硫氧化，硝呼吸和氧呼 吸及CO2固定的一些关键酶。它还应当可能 用于克隆新基因及表达编码蛋白的研究。 MDA反应物可以与PCR引物一起筛选已知序 列或通过简并引物搜索基因家族的新成员， 提供了一个发现具有科学或商业价值蛋白的 新途径。
பைடு நூலகம்
PCR技术原理
第31页，共76页。
温度与时间的设置：
• 设置变性-退火-延伸三个温度点 • 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在
90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温 至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下， 使引物链沿模板延伸
• 对于较短靶基因（长度为100～300bp时） 可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火 与延伸
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点
– 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处
第23页，共76页。
⑦引物的特异性：
– 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性
⑧引物量：
– 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol， 以最低引物量产生所需要的结果为好
• 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物， 55℃为选择最适退火温度的起点较为理想
第34页，共76页。
引物的复性温度
通过以下公式帮助选择合适的温度：
• Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） • 复性温度=Tm值-（5～10℃）
– 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L 为宜
• Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶 的活性，使反应产物减少
第30页，共76页。
PCR反应条件的选择
• PCR反应条件:
温度与时间的设置：
• 设置变性-退火-延伸三个温度点 • 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在
90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃， 引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温 至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下， 使引物链沿模板延伸
• 对于较短靶基因（长度为100～300bp时） 可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合 二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火 与延伸
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点
– 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶 切分析或分子克隆很有好处
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⑦引物的特异性：
– 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性
⑧引物量：
– 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol， 以最低引物量产生所需要的结果为好
• 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物， 55℃为选择最适退火温度的起点较为理想
第34页，共76页。
引物的复性温度
通过以下公式帮助选择合适的温度：
• Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） • 复性温度=Tm值-（5～10℃）
– 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性
• 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L 为宜
• Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶 的活性，使反应产物减少
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PCR反应条件的选择
• PCR反应条件:
PCR的种类及应用
第二个最好是G/C
第9页，共32页。
PCR的各种变体
反向PCR (Inverse PCR, IPCR)
不对称PCR (asymmetric PCR)
多重PCR
荧光定量PCR（Q-PCR)
反转录PCR (reverse transcription,RT- PCR)
巢式PCR (NEST PCR)
退火结合，其延伸方向如图中箭 头所指
4. 经PCR扩增产生的主要是线 性双链DNA分子，它是由左侧的序
列和右侧序列首位连接而成，其接 点就是限制酶的识别位点
12 第12页，共32页。
2022/1/17
应用：
利用反向PCR可对未知序列 扩增后进行分析，探索邻接已 知DNA片段的序列，并可将仅知部
分序列的全长cDNA进行分子克隆，
序列，从而对未知序进行分析研究.
已知序列
11
第11页，共32页。
未知序列
2022/1/17
1. 用一种在靶序列上没有切 点的限制性内切酶 消化大分
子量的DNA
2. 产生的大小不同的线性DNA 片段群体，其中具靶DNA区段的
DNA分子长度不超过2-3Kb,经连 接后环化成环状分子
3. 按靶序列设计的一对向外 引物同靶序列5，--端互补序列
扩增产物。多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA段，其扩增效率并不是完全相同的， 循环参数的增加，会使Taq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混
乱，所以，循环次数不宜过多。
4. 电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加 入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml E、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置
第9页，共32页。
PCR的各种变体
反向PCR (Inverse PCR, IPCR)
不对称PCR (asymmetric PCR)
多重PCR
荧光定量PCR（Q-PCR)
反转录PCR (reverse transcription,RT- PCR)
巢式PCR (NEST PCR)
退火结合，其延伸方向如图中箭 头所指
4. 经PCR扩增产生的主要是线 性双链DNA分子，它是由左侧的序
列和右侧序列首位连接而成，其接 点就是限制酶的识别位点
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应用：
利用反向PCR可对未知序列 扩增后进行分析，探索邻接已 知DNA片段的序列，并可将仅知部
分序列的全长cDNA进行分子克隆，
序列，从而对未知序进行分析研究.
已知序列
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未知序列
2022/1/17
1. 用一种在靶序列上没有切 点的限制性内切酶 消化大分
子量的DNA
2. 产生的大小不同的线性DNA 片段群体，其中具靶DNA区段的
DNA分子长度不超过2-3Kb,经连 接后环化成环状分子
3. 按靶序列设计的一对向外 引物同靶序列5，--端互补序列
扩增产物。多重PCR在一个反应体系中同时扩增多个DNA段，其扩增效率并不是完全相同的， 循环参数的增加，会使Taq酶的消耗增加，再加上每对引物相对退火效率不同，就会使扩增产物混
乱，所以，循环次数不宜过多。
4. 电泳检测及结果分析：取扩增产物10×与26×载样缓冲液(溴酚蓝)混匀上样，同时加 入分子量标准，经2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml E、恒压(200-600V)、电泳1-2小时后，置
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不对称PCR优缺点
优点
缺点
可以获得大量SSDNA， 快速进行下游操作。
前期10-20循环相当于对 称扩增，单链DNA在此 之后才会出现，从而导
比如直接进行测序，
致PCR扩增循环数增加，
或者下游杂交检测无
灵敏度较对称性扩增低。
需经过变性这一步骤。
不对称扩增对于低拷贝 样本的扩增较难，对于
经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时 检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经 费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
多重PCR技术难点
反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相 同.
难点主要体现在前期引物设计过程中——反应 体系的平衡
反应体系不平衡
反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其 模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又 是DNA聚合酶的良好抑制剂（SantaLucia, 2019）。所以，随着 扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制 住了，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加举步 维艰，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。正所 谓"强者更强、弱者更弱"。
2、LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential PCR)
多重不对称PCR重要影响因素
引物二聚体 引物特异性
主要是导致不对称PCR限制性引物和非限制性引 物比例的改变，或者限制性引物绝对量的改变， 从而导致扩增差异化或者扩增失败。
多重不对称PCR设计软件
PrimerPlex（付费）——一款设计特征寡核苷酸 片断、用于同时分析100种核酸序列的工具。
Mpprimer（开放、在线）——最多一次可以设 计6对引物、基于PP3内核。
PP5/Oligo 6+ OMP 6（目前芯片组设计多重不 对称扩增采用的软件）
多重不对称PCR步骤
引物设计 （PP5/OLIG
O6)
BLAST验证引 物特异性
OMP软件验证 引物二聚体评
价
选出出现问 题的引物进 行重新设计
多重不对称PCR
黄桃生（生物芯片组）
多重不对称PCR
多重PCR(Multiplex PCR) 不对称PCR（Asymmetric PCR） 获得大量不同片段的单链DNA（SSDNA）
多重PCR
又称多重引物PCR或复合 PCR，它是在同一PCR反 应体系里加上二对以上引 物，同时扩增出多个核酸 片段的PCR反应，其反应 原理，反应试剂和操作过 程与一般PCR相同.
病原体检测需要更详尽
的PCR设计和优化。
不对称PCR设计
设计不对称PCR引物时，限制性引物的Tm值较非限 制性引物Tm值高4~6°，扩增效果更佳。
不对称PCR设计在于控制限制性引物（低浓度引物） 的绝对量，限制性引物过多或过少，均不利于 SSDNA的制备。限制性引物量可以考虑设置在0.81.5P之间。
1、扩增单一基因中多个 片段（华法林检测）
2、扩增不同基因中多个 片段（HPV分型）
多重PCR技术优点
高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病 原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分 型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。
系统性：多重PCR很适宜于成组病原体的检测， 如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞 厌氧菌等同时检测。
不对称PCR
用不等量的一对引物进行模板的扩增，PCR扩增后产生 大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制性引物和限 制性引物。
在扩增过程前10-20个循环，其扩增产物主要是双链DNA， 但当限制性引物(低浓度引物)消耗殆尽，不再引导扩增， 而非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR会继续进行，从 而就会产生大量的单链DNA。
将所有引物并 入一贯体系进 行实验验证
每对引物进行 单扩并验证不 对称扩增引物
最佳比例
谢谢
导致不平衡的原因：
1、引物特异性； 2、最佳退火温度不一致；
3、引物二聚体；4、模板量不同；5、引物扩增效率
引物特异性
如果引物与体系中其他非目的基因片段结合能 力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受 到不一致
将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行 PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引 物的最佳退火温度接近。
引物扩增效率
这个因素很重要，但也很笼统，它也许包含了 上面提到的几个因素，但更多的因素还不清楚。 引物的扩增效率到目前为止，还没有一个可以 明确的定量计算方法。
目前也有文章提出使用统计学方法，利用qPCR 的数据建立一个模型，来预测引物与目标序列 的扩增效率。 srvgen.upct.es/efficiency.html
前期引物设计时减少最佳退火温度的差异，最 佳退火温度的差异不超过3~5°为宜。
引物二聚体
包括引物间的二聚体 以及引物自身所形成 的发卡结构，还有一 类是第三方DNA介导 的二聚体，这些二聚 体和非特异引物一样 都会干扰引物与目标 结合位点的竞争，影 响扩增效率。
针对不同对引物之间 二聚体，目前可以采 用Visual OMP6软件 （7天试用版）进行验 证。
设置限制性引物量后，再通过实验验证限制性引物 浓度和非限制性引物浓度的比例，目前常用比例1:3、 1:5、1:10、1:15、1:20进行优化，一般情况下，1:10、 1:20比例情况下效果可能更佳。
增加单链的方法
1、纳米金微粒介导不对称扩增
纳米金颗粒可以增强PCR扩增效率和特异性，有可 能是由于金纳米颗粒与单链引物之间特异性结合，类 似单链结合蛋白SSB功能，一直PCR非特异性扩增， 更重要的可能是，金纳米颗粒的热效率和热传导，在 液相中，纳米颗粒可以快速传递热量并且与周围环境 在10~200ps内形成热平衡，增强扩增效率。通过金纳 米颗粒介导进行的不对称PCR，可以获得与普通不对 称PCR更好的效果。