第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产
植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产
1.1 植物代谢产物 （1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必
须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初 生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植
物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为 次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物， 比较稳定，可以在体内积累。
次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加 剂、工业原料等。
紫杉醇简介
• 紫杉醇：二萜类化合物 • 最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分
离 • 广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌
等十几种癌症 • 目前主要来源于红豆杉属植物
市场需求
抗癌一线用药
销售额年增长率5亿美元
480 350
1000 780
620
200
0 2000年
2002年
2004年
需求量
图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）
药源问题
• 红豆杉
主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物 种之一
• 生长缓慢 分布有限 Taxol含量低
树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人
理论需求量
2g /人, 500万人/年 1000kg/年
实际销量
350 kg/年
紫杉醇供需相差十分悬殊
30
25 5
12
10 6.6
5
3.4
0.8
0
1992 1994 1995 1998 1999 2000 2001 2002
图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）
1000 800 600 400 300
植物组织细胞培养技术生产此生代谢产物
植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的应用摘要：植物组织细胞培养是现代生物技术应用最重要的一个方面，它是一个应用广泛和快速发展的技术。
植物组织细胞培养技术已应用于植物次生代谢产物的生产，并取得很大成效。
本文讲述组织细胞培养技术在药物、食品、化妆品等方面的次生代谢产物生产的一些应用，以及总结了现在主要植物组织培养技术、植物组织培养技术在实践中的应用。
关键词：次生代谢产物细胞培养代谢产物植物的次生代谢产生的活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药(如如抗癌药物紫杉醇、疗伤药物紫草宁、保健药物人参皂甙等)、食品添加剂(如生姜、香子兰等)、调味剂(如胡椒、留兰香等)、食用色素(如花青素等)、油料(如如豆寇油、春黄菊油等)、饮料(如咖啡、可可等)、树胶(如阿拉伯胶等)、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。
尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。
因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
1 植物组织培养技术在实践中的应用[1]21世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容，可以用于：植物育种已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物。
除常规的用器官进行培养，也可以用花药进行花粉单倍体植株育种，这种方法技术简单，对一些植物种来说易于诱导未成熟花粉的分裂，可以进行大群体研究，可以迅速而大量的产生单倍体，具有迅速纯合、选择效率高、排除杂种优势干扰、突变体筛选、消除致死基因等优点。
用于脱毒和离体快繁获得脱除病毒的材料和用于植物材料快速繁殖这方面是目前植物细胞组织培养应用最多最有效的一方面. 世界上受病毒危害的植物很多，而园艺植物受病毒危害更为严重，当植物被病毒侵染后，常常造成生长迟缓、品质变劣、产量大幅度降低等危害，目前，已经在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种作物上大规模应用;离体培养的优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景一致，不受季节和地区的限制，重复性好，所以离体快速繁殖已经广泛应用于果树，中药材等的栽培。
次生代谢产物
1～2
植物细胞培养
3周
14
Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with parent plant material. (After Fowler, 1983)
Chemical product plant Cell yield (% DW) Whole Ratio cell plant yield / yield (% DW) whole plant 0.1 2.1 2.2 3.0 0.3 0.5 2.0 10 2 8 9 7 3 2
外植体的选择
不同外植体的愈伤组织诱导能力和诱导 的愈伤组织合成次级代谢产物能力均不 同 ,所以 ,在利用植物细胞悬浮培养生 产次生代谢产物时 ,选择能诱导出疏松 易碎 ,生长快速且具有较高次生代谢产 物合成能力的愈伤组织的外植体是非常 重要的。 如在茜草愈伤组织培养过程中 ,来源于 叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源 于茎尖和叶的愈伤组织高。
然而
随着人们对植物资源尤其是药用植物的利 用度日益增加，使不少植物资源处于濒危 状态。面对着植物有限的蕴藏量，如何进 行合理有效地开发利用是我们亟待解决的 问题。 自从20世纪50年代提出用植物细胞大量培 养作为工业化生产植物次生代谢产物的一 条途径以来，实践表明，采用植物细胞培 养技术生产次生代谢产物是解决资源问题 的较为有效的途径。
Glutathione Nicotine Anthraquinones Rosmarinic acid Ajmalicine SErpentine Diosgenin
N. tabacum N. tabacum M.citrifolia C. blumei C.roseus C. roseus D.deltoidea
5 植物细胞培养与次级代谢产物制备
细胞株工业化生产需满足条件
（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。 （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。
（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。
（4）目标产物含量高，容易分离提取。 （5）细胞遗传稳定。
3.1 细胞株筛选
（1）一般步骤：
1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位 作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代 培养。 2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体 培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。 3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养， 从中选择分散性好、生长速度快的细胞。 4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产 物含量高的细胞株。 5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物 合成的稳定性。 6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。
（2）细胞株定向富集驯化
①激素自养型细胞株的筛选驯化： 将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、 分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长 好的细胞进行反复继代培养驯化，可以获得激素 自养型细胞。 ②耐受高剂量有毒物质细胞株的筛选驯化：
将愈伤组织或分离到的细胞接种在含高浓度的乙 酸盐、苯甲酸钠等可能对细胞产生毒害的化合物的培 养基中反复继代培养训化，不断提高这些成分含量， 可以获得耐受高剂量有毒物质细胞株。
细胞工程 Chapter 5
2、植物单细胞分离与小规模培养
2.1 Single cell separation
酶解方法：纤维素酶和果胶酸酶 水解掉细胞壁 愈伤组织诱导法：(常用)
29
由愈伤组织分离单细胞步骤
步骤：
茎段
1） 诱导产生愈伤组织； 2） 愈伤组织反复继代，使组 织不断增殖，提高愈伤组织松 散性；
第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产
产物产量：每升培养基生产的产物量（mg)。
悬浮培养细胞的同步化
1、分选法 梯度离心；Ficoll；流式细胞仪 2、饥饿法 3、抑制剂法 FdU，HU 4、低温处理 低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的
培养温度，也可达到部分同步化。
第二节 单细胞培养
1、平板培养（plating culture)：将一定密度 悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进 行培养的技术。
2、看护培养（nurse culture) 3、微室培养（micro-chamber culture) 4、其它：饲养层培养技术、双层滤纸植板
培养技术
第三节 植物细胞的规模培养
20%左右的药物由植物衍生 已有30多种化合物在培养物中积累接近或超
前体及诱导子的作用
• 前体作用：细胞培养物中加入前体，可 减弱限速酶作用，促进次生代谢物生产。
• 诱导子（elicitor):一类能引起植物细胞代 谢强度改变或代谢途径改变的物质，主 要指生物来源的化合物，如寡糖、多糖 等。
常用诱导子：真菌诱导子、茉莉酸及其甲 酯、水杨酸等。
培养物最佳转移时间和采收时间
20世纪50年代—— 德、美、英、加拿大 由烟草、蔬菜细胞培养开始，80年代后集 中于药用植物的组培、药用成分的研究。
日本：80年代末，Nitto Denko公司在20kl生物反 应器中实现紫草和人参的大规模细胞培养，以 获得紫草素和人参皂苷，首先作为天然食品添 加剂进入市场。
国内研究成果
国内研究集中于药用植物 20世纪60年代，罗士韦首先开展人参的组培。 1980年起，植物所叶和春主持国家攻关植物
悬浮细胞系的建立
成功的悬浮细胞系： 1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。 2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致
植物细胞培养生产次生代谢产物中的影响因素
植物细胞培养生产次生代谢产物中的影响因素论文导读：植物细胞培养是获得植物有用代谢产物的来源。
但由于许多次生代谢产物储存于液泡里。
并诱导植物细胞次生代谢产物的释放。
关键词：植物细胞培养，次生代谢产物，诱导，两相培养法天然药物是药物的一个重要的组成成分，它来自于植物、动物、矿物和微生物，但以种类繁多的植物为主。
天然药物之所以能防病治病，其物质基础是其中所含有的有效成分，包括一系列的植物细胞次生代谢产物[1] 。
而目前由于环境恶化的影响，一些天然的药用植物近乎灭绝，还有一些由于生境特异，生长缓慢，人工栽培困难，加上长期以来的粗放型和掠夺性的开采，其资源已严重匮乏，自然资源已难以满足日夜增长的临床需要。
因此，应用现代生物技术进行天然药用植物细胞大规模培养提取获得医疗、化妆等所需的活性成分来满足日益增长的市场需求，已在实践中得到了应用。
植物细胞培养是获得植物有用代谢产物的来源。
目前植物细胞培养难以工业放大的一个关键问题是生产技术成本过高，虽然实现了植物细胞的连续使用，减少由于接种量过高而产生的附加成本，缩短培养周期。
但由于许多次生代谢产物储存于液泡里，释放量很少或根本不释放，限制了植物细胞培养技术在工业上的应用，同时也增加了后期分离产物的操作难度，为此如何在适当的条件下优化植物细胞的培养，并诱导植物细胞次生代谢产物的释放，就显得尤为重要。
本文就此从以下方面进行综述。
1.培养条件的调控1.1PH值的影响培养基的酸度对植物细胞代谢产物的分泌很重要，一些次级代谢产物是与H+通过对运方式跨膜传递的。
由于细胞膜两侧的PH值差控制对运的方向，因此当培养基中的PH值降低时，即培养基中的H+离子浓度升高时，就会促使次生代谢产物向胞外运输，而H+会向胞内运输。
如降低培养基的PH值，可有效提高大麦细胞释放七叶氰；高山红景天细胞红景天氰的释放实验也得到同样的效果[2] 。
因此，在植物细胞培养过程中，通常PH作为一个重要的参数被控制在一定的范围内，植物细胞培养的适宜PH值一般为5-6。
植物细胞培养生产次生代谢产物及其应用前景
植物细胞培养的基本过程
植物细胞培养技术的特点
• 与其它的方法相比，应用植物细胞培养技术生产次生代谢 产物爨有以下优点：(1)能够保证产物在一个限定的生产系 统中连续、均匀生产，不受病虫害、地理和季节等各种环 境因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养， 并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物； (3)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效 的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(4)有利于细胞 筛选、生物转化，合成新的有效成分[2]。；(5)有利于研 究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与 创造薪的合成路线，得到价值更高的产品；(6)节省大量用 于种植原料的农田，以便进行粮食作物的生产。
什么是植物组织培养 植物细胞培养是将离体的植物器官、组织或细 胞，在培养了一段时间后，会通过细胞分裂， 形成愈伤组织。由高度分化的植物器官、组织 或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的 脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤 组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽 等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的 试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物 体。依据的原理是植物细胞的全能性 .
• 20世纪70年代以后，该技术有所发展，利用植物细胞工程技术生产一 些药用有效成分在工业上获得成功，据20世纪80年代末期的统计，当 时全世界有40多种植物的细胞培养工程研究获得成功，部分悬浮细胞 培养体系中次生物质的产量达到或超过整体植株的产量，有些药用植 物的研究达到中试水平，其中利用紫草悬浮细胞培养生产紫草宁的成 功令人瞩目[5]。1984年日本的Mitsui公司利用紫草生产紫草宁规模达 到750 L，产物最终浓度达到1400 mg／L。
植物细胞培养技术生产此生代谢产 物的发展
05 第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产(一)
立遗传转化系
• 7. 利用生物反应器大规模培养细胞进行次生代谢产物生产
植物细胞培养与其他细胞培养的区别
植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，通常以一定细胞数的非均相
植物细胞直径一般约10-200微米，平均直径比微生物细胞大30-100倍。
细胞团方式存在。
植物细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡，很容易被剪切力损伤。 与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一 般需要2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月 植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更 困难 植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和 CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。
分裂和细胞代谢。
物理方法：(1)体积选择法：又称分选法;(2)
冷处理法
化学法:(1)饥饿法;(2)抑制法;(3)有丝分裂阻
抑法
四、悬浮培养中细胞生长量的计算
① 细胞计数法：用血球计数板，以 cells/ml表示。
② 细胞体积：将细胞离心于离心管内，测
定细胞层所占体积。细胞密实体积（PCV）
法
③ 细胞鲜重或干重
是简便易行，效果好。但不能在显微镜下追踪细
胞分裂、生长过程。
2. 饲养层培养：是用处理过的、无活性或分裂 慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和 生长。饲养层培养具体方法有四种：① 饲养细 胞与靶细胞混合。② 前者位于下层，后者相反。 ③ 一起培养于液体培养基中。④ 双层滤纸植 板培养
（三）液体浅层静置培养法
根据大规模培养方法主要分为悬浮培养生物反应 器和固定化培养生物反应器两种。
（二）悬浮培养生物反应器
1. 机械搅拌式生物反应器
2.气升式生物反应器
植物细胞培养及次生产物代谢生产
细胞固定化培养技术按照其支持物不 同可以分为两大类：
包埋式固定化培养系统：支持物多采 用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等 ；
附着式固定化培养系统：支持物采用 尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
（四）、利用细胞培养生产有用物质
第四章
植物细胞培养及次生产物代谢生产
一、悬浮培养
二、单细胞培养 三、植物细胞的规模化培养及有
用物质生产
一、悬浮培养（cell suspension culture）
悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖 的技术。
1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 松散易碎。
Circulation through an external loop
旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细
胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制 精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。
②固定化培养系统
这一技术的优点在于： 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研
究特定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所
平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度 和培养基成分互相依赖（负相关）。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
植物细胞培养
克隆愈 伤组织
细胞悬浮
过滤
与培养基 混合
植板
培养
5.2.2.1 单细胞 分离方法
八、 影响悬浮细胞生长的因素
1. 起始愈伤组织的质量 2. 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般 在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的 细胞密度过低往往使延迟期加长。 最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的 最低接种量。 3. 培养条件：培养基、方式、温度、继代周 期。
八、 影响悬浮细胞生长的因素
每个平板形成的细胞团数
植板率＝
每个平板接种的细胞总数
2013-5-28
19
细胞平板培养 (plating culture)
• 优点：
– 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显 微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞 株筛选和突变体筛选的常用方法。
– 由于它具有筛选效率高、筛选量大、操 作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、 分化、生理生化、遗传变异、次生代谢 产物合成等。 • 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造 2013-5-28 成毒害或影响组织吸收。
（三） 愈伤组织诱导法
振荡、或加酶解。
5.2.2.1 植物单细胞小规模培养
• 培养方法 （一）看护培养 （二）饲养层培养 （三）液体浅层静止培养 （四）细胞同步化培养 （五）细胞平板培养 （六）微室培养
2013-5-28 8
（一）看护培养（nurse culture）
• Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 • 优点：简便易行， 效果好。 • 缺点：不能在显 微镜下追踪细胞 分裂、生长过程
植物组织细胞培养技术生产此生代谢产物
重庆文理学院植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的应用摘要:植物组织细胞培养是现代生物技术应用最重要的一个方面,它是一个应用广泛和快速发展的技术。
植物组织细胞培养技术已应用于植物次生代谢产物的生产,并取得很大成效。
本文讲述组织细胞培养技术在药物、食品、化妆品等方面的次生代谢产物生产的一些应用,以及总结了现在主要植物组织培养技术、植物组织培养技术在实践中的应用。
关键词:次生代谢产物细胞培养代谢产物植物的次生代谢产生的活性物质成分已被人类广泛应用,主要集中在研究制药(如如抗癌药物紫杉醇、疗伤药物紫草宁、保健药物人参皂甙等)、食品添加剂(如生姜、香子兰等)、调味剂(如胡椒、留兰香等)、食用色素(如花青素等)、油料(如如豆寇油、春黄菊油等)、饮料(如咖啡、可可等)、树胶(如阿拉伯胶等)、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。
尽管有些植物次生代谢物质并不是很多,但它们与人类健康密切相关,已成为当前生物领域研究关注的重点。
因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用,进行大规模生产,使植物次生代谢物质产量和活性提高。
1 植物组织培养技术在实践中的应用[1]21世纪是生物技术迅速发展的世纪,而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容,可以用于:1.1植物育种已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物。
除常规的用器官进行培养,也可以用花药进行花粉单倍体植株育种,这种方法技术简单,对一些植物种来说易于诱导未成熟花粉的分裂,可以进行大群体研究,可以迅速而大量的产生单倍体,具有迅速纯合、选择效率高、排除杂种优势干扰、突变体筛选、消除致死基因等优点。
1.2用于脱毒和离体快繁获得脱除病毒的材料和用于植物材料快速繁殖这方面是目前植物细胞组织培养应用最多最有效的一方面. 世界上受病毒危害的植物很多,而园艺植物受病毒危害更为严重,当植物被病毒侵染后,常常造成生长迟缓、品质变劣、产量大幅度降低等危害,目前,已经在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种作物上大规模应用;离体培养的优点就是快速,而且材料来源单一,遗传背景一致,不受季节和地区的限制,重复性好,所以离体快速繁殖已经广泛应用于果树,中药材等的栽培。
第五章植物细胞培养及次级代谢产物制备
细胞的同步化培养
细胞工程
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同 时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、 代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直 希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能 保持相对一致的细胞学和生理学状态。
细胞工程
①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。 ②冷/低温处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化 后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同 步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水 仙素等使细胞达到同步化。
核。 • 细菌只有核糖体一种细胞器。 • 植物细胞比微生物细胞大。 • 生命活动与细胞分裂
细胞工程
第二节 植物细胞培养技术
1、植物细胞培养基
无机盐（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有机氮源（水解酪蛋白） 有机酸、维生素 植物生长激素等
细胞工程
植物单细胞分离与小规模培养
（1）单细胞分离
细胞生长各个时期的特点： 滞后期（延迟期）: 细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和 继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变 直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多， 氧气减少； 静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚 至开始死亡。 衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。
长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特 别在制药和食品加工业中更是不可缺少； 据不完全统计，至少有20%左右的药物是由植物衍 生而来，而且每年都有发现许多植物来源的新化合物。
第五章植物细胞培养及次级代谢产物制备
细胞工程
细胞工程
饲养层培养
将饲养细胞先用射线辐射处理，使其失去活性，然后 将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对
于培养细胞能够起到一个饲养作用。
细胞工程
双层滤纸植板培养方法
转移碟滤纸 看护滤纸层
培养细胞
饲养层细胞
培养基
细胞工程
细胞平板培养法
细胞工程
优点：与海藻酸盐、卡拉胶等固定化方法相比，不
需要其它离 子来保证胶的稳定性。
不足：制得的颗粒较大、形状不规则。
固定化细胞活力测定
细胞工程
固定化后需要测定细胞存活率大小，方法有：
（1）荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素） 黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。 （2）呼吸强度测定：
用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。 （3）细胞生长速率的测定：
通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。
细胞工程
第三节 植物细胞培养生产次级代谢产物
概述 培养系统 植物细胞规模培养技术要点 提高细胞次生代谢产物的途径 细胞规模化培养中的有关技术问题
概述
细胞工程
核。 • 细菌只有核糖体一种细胞器。 • 植物细胞比微生物细胞大。 • 生命活动与细胞分裂
细胞工程
第二节 植物细胞培养技术
1、植物细胞培养基
无机盐（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有机氮源（水解酪蛋白） 有机酸、维生素 植物生长激素等
细胞工程
植物单细胞分离与小规模培养
（1）单细胞分离
细胞工程
影响悬浮细胞生长的因素：
• 起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其 外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏 松易碎。
植物次生代谢产物生产
优势:
投资小, 成本低; 使用安全, 植物细胞的培养条件简单, 易于成活; 便于进行遗传操作; 经转化后的目的细胞系易于储藏, 方便生产。
主要方法:
土壤农杆菌介导转化法; 重组病毒感染植株; 基因枪转化法; 花粉管通道转化法。
反义技术
• 反义技术：利用现代分子生物学技术, 将人工合成的反义
RNA 导入到植物基因组内, 与要抑制的代谢途径的关键酶基 因RNA 结合形成双链RNA 来阻断基因的正常表达, 进而促 进目的基因的表达。
次生代谢产物(secondary metabolites)是指植物体内的一大
类细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需的小分子 有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和 生长发育期的特异性，次生产物在植物中的合成与分解过 程称为次生代谢(secondary metabolism) 。
细胞培养核心理论依据：
提高植物细胞培养中次生代谢 产物产量的方法
前言
初生代谢(primary metabolism)是指能使营养物质转换成细
胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢，初 生代谢的产物称为初生代谢产物(primary metabolites)， 如糖、蛋白质、脂类、核酸等。它们是维持细胞生命活动 所必需的。
发根培养
发根(hairy root)：是整体植物或其某一器官、组织(包括
愈伤组织)、单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌感染所产 生的一种病理现象，它起源于单个细胞，形成多分支、生 长迅速的不定根。
优势：具有生长迅速且无需添加外源激素、拥有亲本植株的
特征次生代谢途径和遗传稳定性、处于分化状态等特点， 尤其是它的生长迅速和稳定性的特点是工业化生产梦寐以 求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的。
第5 章植物细胞培养与次生产物生产
第5章植物细胞培养与次生产物生产（5学时）教学目的与要求：深入了解植物细胞在离体条件下的生长特性，掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。
第一节、悬浮培养(suspension culture)一、悬浮培养悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
1．起始培养物的建立●选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。
●选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。
●愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强2．悬浮系的建立3．悬浮细胞的生长与增殖悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
影响悬浮细胞生长的因素：●起始愈伤组织的质量●接种细胞密度●培养条件：方式、温度、●继代周期一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：●悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
●均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
●细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。
第三节、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产一、概述植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化和物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。
次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
1．植物产生代谢产物的类型植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：酚类化合物－黄酮类单酚类醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物－三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜、二萜含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白质氨基酸生氰甙多炔类、有机酸等2．植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。
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第一节 悬浮培养
愈伤组织的诱导和悬浮细胞系的建立
Cell suspension culture: 将单个游离细胞或小细胞 团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 愈伤组织诱导和培养条件优化 1、愈伤诱导（紫草为例） 先获得无菌苗 外植体诱导愈伤 注意：2，4－D的合理使用 2、培养条件优化 在系列单因子比较试验基础上，获得最合适 的培养条件组合。
第四节 培养细胞的次生代谢及产物积累
• 初生代谢产物：淀粉、糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸、 维生素等 • 次生代谢产物：由初生代谢产物经过一些独特的代谢 途径派生出来的小分子化合物，种类繁多，结构各异， 包括酚类、黄酮类、香豆素、木质素、生物碱、有机 酸、糖苷、萜类等。不是植物有机体最主要的成分， 但在保持植物抗逆性、抗病性和抗虫性及担当信号分 子方面起重要作用。 植物次生代谢产物一直是药物和工业原料的重要来 源。
第三节 植物细胞的规模培养
20%左右的药物由植物衍生 已有30多种化合物在培养物中积累接近或超 过原植物含量 日本三井石油化学公司 产业化生产紫草宁
植物细胞规模化培养需满足的条件
1、培养的细胞遗传上稳定，得到产量恒定 的产物； 2、细胞生长及生物合成的速度快，短时间 内得到较高产量的终产物； 3、代谢产物要在细胞内积累而不被迅速分 解，最好释放到培养基中。
培养物最佳转移时间和采收时间
• 愈伤在生长高峰时转到生产培养基上 • 产物含量最高时采收
悬浮细胞系的建立
成功的悬浮细胞系： 1、悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。 2、均一性好：细胞形状和细胞团大小大致 相同。 3、生长迅速
几个重要的生长、生产衡量指标
绝对生长速率：Ra=(w2-w1)/(t· 2、w1分 v),w 别为培养物的最终和起始干重(g)，t为培 养时间(d), v为培养基体积(L)。 产物含量％干重表示：产物占愈伤组织干 重的百分比。 产物产量：每升培养基生产的产物量（mg)。
悬浮培养细胞的同步化
1、分选法 梯度离心；Ficoll；流式细胞仪 2、饥饿法 3、抑制剂法 FdU，HU 4、低温处理 低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的 培养温度，也可达到部分同步化。
第二节
单细胞培养
1、平板培养（plating culture)：将一定密度 悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进 行培养的技术。 2、看护培养（nurse culture) 3、微室培养（micro-chamber culture) 4、其它：饲养层培养技术、双层滤纸植板 培养技术
20世纪50年代—— 德、美、英、加拿大 由烟草、蔬菜细胞培养开始，80年代后集 中于药用植物的组培、药用成分的研究。 日本：80年代末，Nitto Denko公司在20kl生物反 应器中实现紫草和人参的大规模细胞培养，以 获得紫草素和人参皂苷，首先作为天然食品添 加剂进入市场。
国内研究成果Biblioteka 国内研究集中于药用植物 20世纪60年代，罗士韦首先开展人参的组培。 1980年起，植物所叶和春主持国家攻关植物 细胞大量培养方面的专题：紫草、新疆紫草、 人参、三七、红豆杉、青蒿。与化工冶金 （现过程工程）研究所合作进行小试和中试。 建立了新疆紫草高产细胞系。
紫草两步培养的经验
促进愈伤快速生长的因素： 较高浓度生长素、分裂素 较高浓度NH4+ 25℃ 黑暗 促进紫草宁快速合成的因素： 降低生长素、分裂素浓度或不加激素 较低浓度NH4+ 较高浓度Cu2+ 25℃ 黑暗
前体及诱导子的作用
• 前体作用：细胞培养物中加入前体，可 减弱限速酶作用，促进次生代谢物生产。 • 诱导子（elicitor):一类能引起植物细胞代 谢强度改变或代谢途径改变的物质，主 要指生物来源的化合物，如寡糖、多糖 等。 常用诱导子：真菌诱导子、茉莉酸及其甲 酯、水杨酸等。
植物细胞规模化培养体系的建立
1、种子细胞的选择 单细胞克隆结合诱变和压力筛选 2、种子细胞系的增殖与放大培养 3、大规模培养体系的建立 成批培养（batch culture)、饲喂批量培 养；连续培养（continuous culture）；半 连续培养
利用生物反应器进行细胞大量培养
1、搅拌式：可直接借用微生物培养的经验。但剪 切力高。 2、气动式：反应器内传热、传质良好。 但驱除了CO2 C2H4等有利气体，能量利用率低。 3、固定化细胞反应器： 优点：⑴固定化细胞易回收 ⑵固定化细胞有一定程度分化，利于次生代谢 ⑶环境条件易控制，细胞稳定 ⑷适于进行生物转化 缺陷：代谢产物必须是分泌到胞外的
药用植物细胞大量培养的三个步骤
1、诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬 浮细胞系 2、筛选高产细胞系 3、生物反应器中大量培养细胞或细胞团。
高产细胞系的筛选
1、根据细胞表型进行筛选 2、根据单细胞克隆次生代谢产物产量筛选。
两步培养法
1、药用植物组培中为何经常采用两步法？ 许多植物组培研究表明，促进细胞生长的条 件和促进次生代谢物生产的条件并不相同，一些 促进细胞生长的因子往往抑制次生代谢物的合成 和积累。因此宜用两步法。 2、何为二步法？ 第一步，愈伤培养在生长培养基上使细胞快速增殖。 第二步，细胞生长通过指数生长期后，转移到生产 培养基上进行第二步培养，以获得最高次生产物 产量。
植物细胞培养生产次生代谢物的意义
Plant cell culture: 在离体条件下对植物单个 细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的 技术。 • 植物资源短缺：滥采滥挖 • 资源植物栽培的缺陷：占用耕地、受地 域气候限制 • 植物细胞培养的优势：可摆脱对植物资 源的依赖，保护物种多样性和生态环境。
植物细胞培养生产次生代谢物的研究历史