IGY鸡卵黄免疫球蛋白

1概述
卵黄抗体（yolk antibody, IgY）：通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。

2IgY的形成、作用机理与制备
卵黄抗体的形成
禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。

当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体(主要是IgG)在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体；当卵细胞分泌进入输卵管时，流经输卵管的血液中含有的特异性抗体(主要是IgA和IgM)进入卵清中，形成卵清抗体。

IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG。

与卵黄抗体相比，卵细胞在输卵管中移行的时间较短，因而卵清抗体含量极微。

卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用，但同时也会干扰鸡疫苗的免疫效果。

IgY的性质
IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。

正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。

其等电点约为5.2。

IgY与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。

在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。

IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。

IgY在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。

IgY对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。

将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。

IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。

IgY的作用机理
特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。

IgY分离、提纯方法
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。

大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY 是γ卵黄球蛋白。

因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。

多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

1980年，Polson首先提出聚乙二醇(PEG)两步沉淀法，分别用终浓度为3.5%和12%的PEG分步沉淀，用硫酸铵盐析法去除PEG。

1985年，在此基础上提出了冷乙醇沉淀的改进方法，使产量提高，而且能有效地去除残留PEG。

1981年Jensensius等提出了硫酸葡聚糖沉淀法(DS法)，PEG法和DS法的产量相当，但提取的IgY制品含有一定量的杂蛋白。

Bade和Stegemann(1984)用预冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白质并去除脂质，经DEAE柱层析进一步纯化，其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别，且稳定性好，经3次以上冻融，抗体活性未见改变。

1992年Akita等用水稀释法(WD)提纯IgY，每个卵黄可获得100mg
以上的IgY。

此后，Akita等比较了WD法、PEG法、DS法和黄原胶法(Xanthan法)的提纯效果，结果表明：WD法产量最高，其次为DS法，WD法更适合大规模生产。

1993年，Horikoshi提出了冷乙醇分级离心的方法，分别用60%、30%、25%的冷乙醇沉淀离心，得到纯度达99%以上的IgY。

此法适用于大规模制备IgY。

工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。

3IgY在动物疾病防治方面的应用
研究表明，IgY能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。

故常在幼畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的IgY，以使其获得有效的被动免疫。

何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体，对2-3日龄雏鹅进行预防，其保护率高达100%。

杨晓梅等用鸭病毒性肝炎I型鸡胚毒免疫鸡，制备的鸡抗鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体，经实际应用于预防时，雏鸭的平均成活率为96.9%。

IgY在动物疾病治疗方面的应用
目前，卵黄抗体己被广泛应用于许多疾病的防治。

汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎(DHV)的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时，当用1万倍LD50强毒时保护率可达到100%。

张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群，治愈率为95.2%。

此外，应用多种病原菌免疫制备的卵黄抗体还可以防治多种病原菌的感染。

詹丽娥等用IBD、ND和EDS-76三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病，总有效率可达50%以上。

日本成功地从鸡蛋中提取出能够杀死幽门螺旋杆菌的抗体，并以这种抗体为原料制成了能杀死人体内幽门螺旋杆菌的酸奶。

用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞
2. 试剂及配制
LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，备用。

0.1mol/L的CaCl2-MgCl2：80mmol/L MgCl
，20mmol CaCl2。

2
0.1mol/L 的CaCl2：取出1mol/L的CaCl
（11.1gCaCl2加入到100ml四蒸水中）灭菌贮存液10ml加90ml灭菌水稀释至100ml。

1mol/L的CaCl2贮存液事先0.22
2
微米滤膜过滤除菌，后保存于4℃。

3. 实验步骤
（1）从37℃培养16-20h 平板中挑取一个单菌落（直径2-3mm），转到一个含有4ml LB培养基的玻璃试管中，37℃，250rpm振摇过夜培养。

（2）将过夜培养物以1：100的比例转接到含有100ml LB培养基的锥形瓶(500ml)中，37℃，250rpm振摇培养至对数生长期，一般需1.5-3h。

（3）将培养物转移到无菌、冰预冷的2个50ml聚丙烯管中（不要装太满以防离心管破裂），冰上放置10min。

（4）4℃，4100rpm离心10min，以回收细胞。

（5）倒出培养液，将试管倒置1min，以使最后的痕量培养液流出。

（6）沉淀用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2-MgCl2（每100ml培养基用30ml）溶液重悬。

（7）4℃，4100rpm离心10min，倒出培养液（方法同5），回收细胞。

（8）每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L 的CaCl2重悬沉淀。

（9）每2ml重悬细胞液加70μl DMSO（二甲基亚砜），轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上15min。

（10）每2ml细胞悬液再加70μl DMSO，轻旋混匀，至于冰上15min；
（11）迅速将悬液以50-100μl每份分装到冷却的无菌1.5ml离心管中，用封口膜封口，投入液氮中快速冷冻（约1min），贮存于-80℃冰柜。

表达载体的构建（双酶切、连接、转化）
3. 实验步骤
（1） 取一支干净、灭菌的Eppendof 管，按下表加入各种试剂将连接有目的片段的克隆质粒进行双酶切
（2） 37℃保温１－２小时（时间可适当延长）
（3） 取2μl 左右的反应液加入2μl 电泳加样缓冲液，电泳，根据条带的粗细和亮暗和估计目的片段和载体片段的比例。

（4） 取干净、灭菌Eppendof 管，按下表加入各试液进行连接
（5） 连接反应：16℃过夜（长于8小时） （6） 转化
1) 准备1.5ml 的离心管，冰浴预冷。

2) 取100ul 感受态细胞，加入10ul 连接液，冰浴30min ，期间切忌振动。

3) 42℃热激90sec ，不要振动(关键步骤，一定注意温度及时间)。

4) 冰浴2min 。

5) 加LB 培养基890ul ，37℃，225rpm 或者200rpm ，培养45-60min 。

6) 3000rpm×2min 离心。

7) 留100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含抗生素（根据不同的表达载体选择不同的抗生素）的LB 琼脂平板，若平板放置时间过长可在涂板时涂上适当量的相应的抗生素（10-30ul ）。

8) 37℃ 培养箱正置至平板上无明显液体流动，倒置培养过夜，约16-20小时，观察是否长出单菌落。