微生物检验常用技术与方法—临床真菌检验技术与方法(微生物检验课件)
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
临床真菌检验 技术与方法
掌握真菌的检验方法。 熟悉真菌标本采集及注意事项； 熟悉真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法。
第一节 真菌形态检验技术
一、标本的采集和处理
1. 标本的采集—— 根据真菌感染部位采集不同的标本。 浅部真菌感染 取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本
深部真菌感染
取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本
培养基用途 真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌） 深部真菌培养 真菌的培养与鉴定
第二节 真菌培养技术
显色鉴定培养基
代谢基质 产色基团
原
真菌的酶
理
分解代谢基质
真菌特异性酶的 底物（无色）
产色基团游离 （显色）
4. 病理组织检查 用于深部真菌感染的诊断。
5. 核酸检测
用于真菌的分型鉴定。
有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相
6. 真菌毒素的检测 色谱法等多种方法。
7. G试验
用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。
返回章内容
第四节 真菌检验G试验、GM试验
应用背景
• 侵袭性真菌病临床表现不典型，确 诊通常需要侵入性的组织标本，因 此有较高的漏诊率。目前国内大多 数医院都在开展非侵袭性实验室技 术如G试验和GM试验，成为真菌 感染的诊断标准之一，以提高真菌 感染的阳性率。
同化氮源试验
• 检测真菌对氮源利用能力的试验，主 要用于鉴定酵母菌。
明胶液化试验
• 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋 白，使其失去凝胶性质而不能凝固。
尿素分解试验
• 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。
第三节 真菌的鉴定方法
二、免疫学检查
皮肤试验
• 提取真菌抗原，进行皮内注射或斑贴试验，观 察注射或试验部位有无红肿硬结出现。
第四节 真菌G试验、GM试验
定义
G试验
• 又称1,3-β-D葡聚糖试验，检测的是真菌的细胞壁成分 1,3-β-D葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释 放该物质，使血液及体液中含量增高。1,3-β-D葡聚糖可 特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物 凝固，故称G试验。
GM试验
• 检测的是半乳甘露聚糖(glactomannan,GM)，半乳 甘露聚糖是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁的一种 多糖，菌细胞壁表面菌丝生长时，半乳甘露聚糖 从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原，可 以通过酶联免疫吸附试验法进行检测。
第一节 真菌形态检验技术
二、直接镜检
标本+标本处理液
（加温） 毛发或皮屑等
镜检
注意真菌与其他 混杂物的鉴别
标本处理液： （1）KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料。 （2）生理盐水：用于观察真菌的出芽现象。 （3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：透明力较强，只限于不
透明的标本。
第一节 真菌形态检验技术
第一节 真菌形态检验技术
2. 标本采集注意事项
标本来源要适宜 用药前采集标本 严格无菌操作 标本量要充足 立即送检
第一节 真菌形态检验技术
3. 检验程序
临床标本
直接检查
核免
形
酸疫
态
检学
学
测检
检
查
查
直接 镜检
染色 镜检
分离培养
观察菌落
镜生 其 检化 他
反鉴 应定
试 验
病理组 织标本
动物实验
PAS HE
应用：白假丝酵母、其它鉴定诊断方法
芽管
2. 芽管形成试验
方法： 待测菌+0.5~1ml血清 37℃水浴2~3小时
镜检
结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管。
应用：白假丝酵母菌的鉴定。
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
3. 动物接种
用于分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究 抗真菌药物。
血清学检测
• 检测真菌的抗原或抗体，例如：胶乳凝集试验、 酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、放射免疫 分析等。
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
l. 厚膜孢子形成试验
假菌丝
厚膜孢子
方法：
待测菌
接种
玉米粉吐温-80琼脂
25℃孵育1~3天
每天于显微镜下观察
结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假菌丝，假 菌丝顶端见1~2个厚膜孢子。
白色念珠菌： 蓝绿色 热带念珠菌： 蓝灰色、铁蓝色 克柔念珠菌： 粉红色 光滑念珠菌： 紫色 近平滑念珠菌： 白色
第二节 真菌培养技术
二、培养方法
试管培养法 多用于菌种传代接种与保存。
大培养法
仅用于培养生长繁殖较快的真菌。
小培养法
观察真菌结构及生长发育过程。
玻璃棒 载玻片 培养基 盖玻片
无菌蒸馏水
一、基本条件
1. 常用工具 平皿、试管、接种针、接种环、接种钩、培养箱等。
第二节 真菌培养技术
一、基本条件
2. 培养基
真菌营养要求不高，最适pH 4.0～6.0。常用的培养基：
培养基名称 沙氏培养基 放线菌酮-氯霉素琼脂 玉米粉吐温-80琼脂 马铃薯葡萄糖琼脂 尿素琼脂 心脑浸液葡萄糖血琼脂 显色鉴定培养基
三、染色镜检
1. 革兰染色：各种真菌均为革兰阳性。（图1） 2. 乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色。（图2） 3. 墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色。（图3） 4. 荧光染色：荧光显微镜下发出荧光。 5. 糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色。
（图1）
（图2） 返回章内容
（图3）
第二节 真菌培养技术
第二节 真菌培养技术
三、生长现象
观察菌落 生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等。
酵母型菌落
类酵母型菌落
返回章内容
丝状菌落
第三节 真菌的鉴定方法
一、常用生化试验
糖（醇）类 发酵试验
同化碳源试验
• 检测真菌对单糖、多糖、醇类等发酵 情况。
• 检测真菌对糖类中的碳源利用能力的 试验，主要用于鉴定酵母菌。
掌握真菌的检验方法。 熟悉真菌标本采集及注意事项； 熟悉真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法。
第一节 真菌形态检验技术
一、标本的采集和处理
1. 标本的采集—— 根据真菌感染部位采集不同的标本。 浅部真菌感染 取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本
深部真菌感染
取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本
培养基用途 真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌） 深部真菌培养 真菌的培养与鉴定
第二节 真菌培养技术
显色鉴定培养基
代谢基质 产色基团
原
真菌的酶
理
分解代谢基质
真菌特异性酶的 底物（无色）
产色基团游离 （显色）
4. 病理组织检查 用于深部真菌感染的诊断。
5. 核酸检测
用于真菌的分型鉴定。
有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相
6. 真菌毒素的检测 色谱法等多种方法。
7. G试验
用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。
返回章内容
第四节 真菌检验G试验、GM试验
应用背景
• 侵袭性真菌病临床表现不典型，确 诊通常需要侵入性的组织标本，因 此有较高的漏诊率。目前国内大多 数医院都在开展非侵袭性实验室技 术如G试验和GM试验，成为真菌 感染的诊断标准之一，以提高真菌 感染的阳性率。
同化氮源试验
• 检测真菌对氮源利用能力的试验，主 要用于鉴定酵母菌。
明胶液化试验
• 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋 白，使其失去凝胶性质而不能凝固。
尿素分解试验
• 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。
第三节 真菌的鉴定方法
二、免疫学检查
皮肤试验
• 提取真菌抗原，进行皮内注射或斑贴试验，观 察注射或试验部位有无红肿硬结出现。
第四节 真菌G试验、GM试验
定义
G试验
• 又称1,3-β-D葡聚糖试验，检测的是真菌的细胞壁成分 1,3-β-D葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释 放该物质，使血液及体液中含量增高。1,3-β-D葡聚糖可 特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物 凝固，故称G试验。
GM试验
• 检测的是半乳甘露聚糖(glactomannan,GM)，半乳 甘露聚糖是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁的一种 多糖，菌细胞壁表面菌丝生长时，半乳甘露聚糖 从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原，可 以通过酶联免疫吸附试验法进行检测。
第一节 真菌形态检验技术
二、直接镜检
标本+标本处理液
（加温） 毛发或皮屑等
镜检
注意真菌与其他 混杂物的鉴别
标本处理液： （1）KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料。 （2）生理盐水：用于观察真菌的出芽现象。 （3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：透明力较强，只限于不
透明的标本。
第一节 真菌形态检验技术
第一节 真菌形态检验技术
2. 标本采集注意事项
标本来源要适宜 用药前采集标本 严格无菌操作 标本量要充足 立即送检
第一节 真菌形态检验技术
3. 检验程序
临床标本
直接检查
核免
形
酸疫
态
检学
学
测检
检
查
查
直接 镜检
染色 镜检
分离培养
观察菌落
镜生 其 检化 他
反鉴 应定
试 验
病理组 织标本
动物实验
PAS HE
应用：白假丝酵母、其它鉴定诊断方法
芽管
2. 芽管形成试验
方法： 待测菌+0.5~1ml血清 37℃水浴2~3小时
镜检
结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管。
应用：白假丝酵母菌的鉴定。
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
3. 动物接种
用于分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究 抗真菌药物。
血清学检测
• 检测真菌的抗原或抗体，例如：胶乳凝集试验、 酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、放射免疫 分析等。
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
l. 厚膜孢子形成试验
假菌丝
厚膜孢子
方法：
待测菌
接种
玉米粉吐温-80琼脂
25℃孵育1~3天
每天于显微镜下观察
结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假菌丝，假 菌丝顶端见1~2个厚膜孢子。
白色念珠菌： 蓝绿色 热带念珠菌： 蓝灰色、铁蓝色 克柔念珠菌： 粉红色 光滑念珠菌： 紫色 近平滑念珠菌： 白色
第二节 真菌培养技术
二、培养方法
试管培养法 多用于菌种传代接种与保存。
大培养法
仅用于培养生长繁殖较快的真菌。
小培养法
观察真菌结构及生长发育过程。
玻璃棒 载玻片 培养基 盖玻片
无菌蒸馏水
一、基本条件
1. 常用工具 平皿、试管、接种针、接种环、接种钩、培养箱等。
第二节 真菌培养技术
一、基本条件
2. 培养基
真菌营养要求不高，最适pH 4.0～6.0。常用的培养基：
培养基名称 沙氏培养基 放线菌酮-氯霉素琼脂 玉米粉吐温-80琼脂 马铃薯葡萄糖琼脂 尿素琼脂 心脑浸液葡萄糖血琼脂 显色鉴定培养基
三、染色镜检
1. 革兰染色：各种真菌均为革兰阳性。（图1） 2. 乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色。（图2） 3. 墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色。（图3） 4. 荧光染色：荧光显微镜下发出荧光。 5. 糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色。
（图1）
（图2） 返回章内容
（图3）
第二节 真菌培养技术
第二节 真菌培养技术
三、生长现象
观察菌落 生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等。
酵母型菌落
类酵母型菌落
返回章内容
丝状菌落
第三节 真菌的鉴定方法
一、常用生化试验
糖（醇）类 发酵试验
同化碳源试验
• 检测真菌对单糖、多糖、醇类等发酵 情况。
• 检测真菌对糖类中的碳源利用能力的 试验，主要用于鉴定酵母菌。