G418原理及筛选方法

G418原理及筛选方法
原理
分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型，至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一左意味着表达，只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。

由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件，通常根据新表型筛选軽軽体。

一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（ne。

抗性基因）携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418就是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似，它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核与真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞，也包括原生动物与蠕虫。

就是稳定转染最常用得选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后，则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。

G418得这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。

英实G418本身有很好得杀菌效果，在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不就是很大，那就就是:在老外得一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物，其药理作用完全一样。

所以没有必要再用，而且由于另外抗生素得添加实际增加氨基糖貳类药物得浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间得交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳左整合子较好，但这种观点就是很多年以前得观点了,而且只就是少数人得观点。

我两种方法都用过，但没有特异得比较过,感觉都可以。

磷酸钙便宜，但对溶液配置与实验操作要求很髙，尤其就是溶液得pH值,要求精确到小数点后2 位。

脂质体就是现在主流
得转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳左表达不行。

非脂质体就是这几年发展很快得技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵,Qiagen就有一个系列。

我个人觉得不必要花太多时间在这方而,自己实验室用得好得技术可以坚持，没有经验得可以选择一个较著名得公司得产品开始，购买之前先下
载个说明书瞧瞧。

有精力就比较一下几种方法，一般得达到目得就行了。

关键就是实验设讣。

------ 主要参考《细胞培养与分了细胞学技术》与《分f•克隆》G418筛选实验设计
筛选之前
由于每种细胞对G418得敏感性不同，一般变动在iooug/nil~ 10ooug/nil范围。

而且不同得厂家生产得相同浓度得G418得活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定您得细胞对这一批G418得最佳筛选浓度.尽管如此，特性明确得细胞系G418得最佳用量还就是稳泄得。

《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418得最佳用屋。

具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/mL,在iooug/mL~img/mL得G418浓度范国内进行筛选，选择出在io~i4d内使细胞全部死亡得最低G418浓度来进行下一步得筛选试验。

瞧下而得一个试验：3“。

6个细胞电转后，分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4% 得汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

所以汇合度对G4I8筛选结果得影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过5。

％!
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达岀蛋白质。

所以筛选不能太早;但就是也不能太
晚,因为转染了外源基因得细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入得细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞得代谢
G418得浓度与活性都会下降,所以每3~5d都要更换一次含有G418得筛选液。

这时药物浓度可以降
至200ug/ml.J
培养液
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡,孔中只剩下得细胞寥寥无几。

这时会岀现两个问题：1、死亡得细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达得阳性细胞死亡，即非选择性死亡。

2、孔中细胞数目很少，细胞之间得信号会变得很弱,也会导致阳性细胞得状态不佳甚至死亡。

这个时候需要一种特殊得培养液:假如您要转染3丁3细胞，任3丁3细胞汇合度达到80% 得时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，与新鲜得培养液按1：1混合备用。

再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

挑选单克隆得优化
为了尽量减少阴性克隆得死亡给阳性克隆造成得不利影响以及增加阳性克隆得得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆，加药后，在髙倍镜下，阳性克隆与阴性克隆很容易辨认,在阳性克隆下用记号笔做个标记。

然后刮除阴性克隆,消化阳性克隆后继续筛选培养;或者用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新得孔中培养。

最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。

鉴定之后
一般经过4周左右得筛选，得到得阳性克隆都比较稳定。

但就是外源基因如果没有整合到基因
组中得话，目得基因还就是很容易丢失得。

但就是外源基因整合到基因组中得概率太小了，而且就是
随机整合，会导致表达得目得蛋白得量产生很大差异。

随着培养时间得延续，那些丢失了外源基因得
细胞与很少表达目得基因得细胞会占据优势，强表达目得蛋白得细胞会越来越少。

这样再次筛选就是必不可少得。

只有经过2次以上得筛选之后才能找到那种我们想要得强分泌目得蛋白得，遗传稳定得细胞克隆。