27149439_猪圆环病毒2_型检测技术研究进展

猪圆环病毒（Porcine circovirus ，PCV ）属圆环病毒科、圆环病毒属，病毒基因组为单股负链环状DNA ，病毒呈二十面体对称，无囊膜结构，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。

猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒1型（Porcine Circovirus 1，PCV1）和有致病性的猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2），猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus 3，PCV3），猪圆环病毒4型（Porcine Circovirus 4，PCV4）。

PCV2主要侵害机体的免疫系统，引起机体继发感染断乳仔猪多系统衰竭综合征（post-weaning multisystem wasting syn-drome ，PMWS ）、猪皮炎和肾病综合征（porcine dermatitis andnephropathy syndrome ，PDNS ）、猪呼吸道病综合征（porcine respi-ratory disease complex ，PRDC ）、母猪繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、仔猪先天性震颤等疾病。

2000年，我国首次报道了PCV2感染。

目前，PCV2感染在我国猪群中广泛流行，种猪有很高感染率，与其他疾病混合感染现象严重。

PCV2现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome ，PRRS ）之后新发现的引
猪圆环病毒2型检测技术研究进展
陈 旭，汤德元*，杨志刚，晏仁潭，韩超逸，罗 柳，陈阊峥，袁盛林，廖正波
（贵州大学动物科学学院，
贵州 贵阳 550025）基金项目：贵州省科技支撑计划项目，黔科合支撑[2021]一般162
作者简介：陈旭（1998-），女，土家族,贵州铜仁，硕士研究生，研究方向为动物传染病病原分子生物学， E-mail ：*****************
*通信作者：汤德元(1964- )，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。

E-mail ：
**************起猪免疫障碍的重要传染病病原，因此建立即时有效的检测PCV2的技术方法尤为重要，文章综述了多种PCV2检测技术，旨在为养殖场PCV2有关疾病的检测防控提供技术支持。

1 病毒分离培养
PCV2可选用猪肾细胞、PK-15细胞、猪睾丸细胞等来进行分离培养，取病死猪的淋巴结组织研磨，加PBS 缓冲液制成悬液，-20℃反复冻融3次后离心取上清液，经过滤器过滤除菌，接种易感细胞，置于37℃培养箱，盲传1~3代后进行PCV2抗原或核酸检测加以鉴定。

何锡忠等利用有限稀释法从含猪PCV2的PK15细胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8细胞株，将该克隆株在细
胞瓶中静置培养，连续传代40代后病毒滴度最高可达107.5TCID 50/mL ，用生物反应器培养病毒滴度最高可达108.0TCID 50/mL 以上。

郭光富等将阳性病料悬液经0.22 μm 滤膜
过滤后接种PK15细胞，连续盲传5代后收取细胞病毒液并提取DNA ，通过PCR 检测及间接免疫荧光（IFA ）鉴定出分离株为PCV2，并命名为TAIZ110926株。

Cruz TF 等将PCV2接种到添加有d-氨基葡萄糖的猪睾丸细胞中，并使用shell
小瓶技术对其进行培养，经历15次传代后，RT-PCR 监测结果显示，该方法比传统吸附法获得的DNA 量高出2倍。

病毒分离培养可以观察到病毒接种细胞后产生的细胞病变，但此方法首先需要培养出状态较好的病毒易感细胞，这个过程比较耗时，操作过程中容易遭到污染，且血清成本高，因此不适用于常规
检测。

2 电镜观察
电子显微镜是用电子束代替可见光的显微装置，一种高放大，高分辨的大型精密仪器。

电镜检测技术主要有扫描电镜和透射电镜，扫描电镜主要通过发射电子聚焦光束来扫描PCV2样品的表面形态确定病毒，透射电镜则是通过电子束穿透组织和细胞来观察PCV2感染细胞内的超微结构来检测病毒。

将待检组织样本通过固定，脱色，包
埋，切片，染色等步骤制成超薄切片，在电子显微镜下通过调节放大倍数进行电镜观察。

Liu Z 等使用29 nm （2.9 Å）分辨率的单颗粒冷冻电子显微镜观察到PCV2的1.67 MDa 病毒样颗粒。

电镜法具有直观，快捷等优点，但是电子显微镜设
备价格较高，且该法只能观察病毒的外观形态，很难与同科的病毒相区别。

3 分子生物学检测
3.1 聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（PCR ）是利
用DNA 半保留复制原理，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，
并设计特异性引物做启动子，加
入DNA聚合酶、dNTP，从而完成特定基因的体外复制。

这是一种快速，灵敏，特异性强，对样本纯度要求较低的病原学检测方法。

在普通PCR的基础上，发展出了多种形式的PCR技术，包括实时荧光定量PCR、多重PCR、数字微滴PCR、其他PCR等。

3.1.1 常规PCR
通过提取待测样品的DNA，将DNA加入合适的PCR反应体系中，调节反应温度进行扩增，从而获得目的基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测所获条带是否符合目标条带。

苗丽娟等通过Genbank 对猪PCV2基因的序列进行分析，用Primer 5.0设计了ORF2基因的扩增引物，引物的序列为P1：5'-GTCCTGGTCGTATITACTGT-3'；P2：5'-GTCACAACGCCCTCCTG-3'。

首先将需要检验的病料冻融1~2次后使用灭菌剪刀将病猪的脾脏、淋巴结、扁桃体等器官剪下小块，将其剪碎后加入PBS缓冲液进行研磨，倒入离心管中离心取上清，提取DNA，按照设计的PCR反应体系加入所需试剂及DNA进行PCR 扩增，获得447 bp大小的ORF2基因片段，敏感性检验分析表明检测样本DNA浓度最低可达到9.8×10-4 ng/μL，且PCR反应具有良好的稳定性和重复性。

3.1.2 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次PCR循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

吴叶好等建立了PCV2质粒的荧光定量PCR。

使用其所在实验室构建并保存的感染性克隆质粒pcDNA3.1（+）-
PCV1-2m-V5作为模板，根据该质
粒的测序结果，设计1对荧光PCR
引物（ORF2-V5 F1/R1）和探针
（ORF2-V5-Probe），经过对荧光
PCR反应体系进行优化后，确定
以20 μＬ作为反应体系，优化后
的反应体系为10 μＬ 2×T5 Fast
qPCR Mix（Probe），6.8 μＬ ddH
2
O，
F2／R2各0.8 μＬ，0.6 μＬ探针，
1.0 μＬ模板。

反应条件：95℃ 2 min；
95℃ 10ｓ；60℃ 30ｓ，设置40个
循环。

该方法的最低检测浓度可达
1.29×101 copies／μＬ，且特异性
和重复性试验结果判定均为良好。

3.1.3 多重PCR
多重PCR是在同一PCR反应
体系里加上2对以上引物，同时扩
增出多个核酸片段的PCR反应，其
反应原理，反应试剂和操作过程与
一般PCR相同。

庞歌等为了建立
PCV1和PCV2混合感染快速检测
的PCR方法，根据GenBank已发
表PCV1和PCV2全基因组序列，
设计合成4条引物，通过构建它们
的阳性质粒、反应条件的优化、敏
感性试验和特异性试验，建立了
PCV多重PCR检测方法，可扩增出
PCV1和PCV2长度分别为726 bp
和433 bp特异性基因片段。

结果显
示，建立的PCV多重PCR可检测
到50个拷贝的PCV1和PCV2目的
基因，具有良好的特异性和敏感性。

对现场42份疑似PCV2阳性的样本
进行检测，结果表明PCV1、PCV2
的阳性率分别为33.3%和45.2%，
其中PCV1和PCV2混合感染阳性
率为16.6%。

3.1.4 数字微滴PCR
数字PCR能够对核酸进行定
量分析，通过将大量稀释后的核酸
溶液分散至芯片的微反应器中，每
个反应器的核酸模板数少于或等于
1个，这样经过PCR循环之后，有
1个核酸分子模板的反应器就会给
出荧光信号，没有模板的反应器就
没有荧光信号，根据相对比例和反
应器的体积，就可以推算出原始
溶液的核酸浓度。

数字微滴PCR
（ddPCR）因其高灵敏度、强抗干扰
性和绝对定量等优点被广泛应用于
动物病毒的检测。

ddPCR与qPCR
最大的不同点在于通过乳化方式获
得大量的独立微小反应体系，使抑
制剂以及其他杂质对扩增效率的影
响大大削弱，提高了检测的稳定性
和灵敏度。

同时它的绝对定量不需
要依赖标准曲线来获得，省下了制
备及检验标准品的时间。

吴朦晨等
针对PCV2 ORF1基因设计引物和
探针，通过对引物探针浓度、退火
温度以及荧光阈值等条件的优化，
确定反应体系中引物和探针终浓度
分别为0.7 μmol/L和0.25 μmol/L，
且退火温度为59 ℃时，建立了具有
最佳的扩增效率的PCV2的ddPCR
检测方法。

经过特异性、灵敏性和
重复性试验，表明该检测体系灵敏
度相比传统qPCR方法高出10倍以
上，对PCV2的最低检测浓度可达
2.93拷贝/μL。

3.1.5 其他PCR
随着纳米技术在生命科学领域
的逐步渗透，采用纳米颗粒与PCR
技术相结合，可以去除非特异性扩
增、提高反应灵敏度。

梁琳等建
立了一种同时检测PCV2和PCV3
的双重纳米PCR（nano-dPCR）方
法，该方法对PCV2和PCV3两种
病毒的最低核酸检测量分别为93.2
和91.6拷贝/μL，其敏感性比普
通PCR高100倍，该方法的特异性
和敏感性良好，为PCV2和PCV3
早期感染进行快速、敏感的鉴别诊
断提供了新方法。

大量研究表明纳
米材料由于其特殊的理化性质，能够和DNA分子进行非共价结合。

HUANG Y等开发了一种基于超敏纳米颗粒DNA探针的PCR测定法（UNDP-PCR）用于PCV2检测，该测定的灵敏度是传统PCR的500倍，检测限为血清中纯化的PCV2 DNA 的2个拷贝和PCV2的10个病毒拷贝，此法能可靠地排除基于抗体检测的假阴性结果，为现场PCV2感染提供了无核酸提取，特异性强，超敏感，经济快速的诊断方法。

3.2 环介导等温扩增法
环介导等温扩增法（LAMP）是2000年时开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在恒温条件保温30~60 min，即可完成核酸扩增反应。

QIU X等建立了一种LAMP方法来检测PCV2的2a、2b基因型，使用此法最低可以检测出1个拷贝的病毒粒子，且与PCV2c无交叉反应，为PCV2a 和PCV2b感染的大规模检测提供了更灵敏特异的手段。

廖帆等建立了PCV2 LAMP可视化检测方法，试验根据PCV2 ORF1基因中的保守序列设计合适的LAMP引物对，63℃恒温扩增45 min即可出现梯形条带，检测下限为1.0×101 copies/L，较普通PCR敏感性提高100倍，在产物中加入SYBR Green Ⅰ染料后可实现可视化检测，对72份临床样品进行检测，PCV2阳性率为47.2%（34/72），与qPCR检测的符合率为98.6%，与普通PCR的符合率为94.4%。

此法的灵敏度高，特异性强，且不需要电泳，可以进行室外检测，但反应需要的仪器价格昂贵，检测成本较高。

3.3 重组酶聚合酶扩增
重组酶聚合酶扩增（RPA）技术使用重组酶与引物结合形成的复
合物能在模板上寻找同源序列，定
位后就会引发链交换反应并启动
DNA合成对模板上的目标区域进
行指数式扩增。

为了能获得不依
赖于琼脂糖凝胶电泳且更快速的核
酸扩增方法，Yang Y等针对PCV2
ORF2基因开发了使用实时荧光检
测（PCV2实时RPA测定）和RPA
结合侧流试纸（PCV2 RPA LFD测
定）的两种测定方法。

这两种测定
方法均可在37℃ 20 min内可检测出
每个反应的病毒拷贝数，对PCV2
具有高度特异性和灵敏性。

Wang J
等开发了一种实时重组酶聚合酶扩
增（RPA）测定法，该测定仅检测
PCV2，没有与猪中重要的其他病
原体发生交叉反应，以PCV2 DNA
为模板，实时RPA的分析灵敏度为
103个拷贝，通过测试38个现场样
品并与实时PCR进行比较，检测结
果显示具有100%诊断一致性，表
明实时RPA测定为快速，简单和可
靠地检测PCV2提供了一种替代工
具，特别是在没有专业设备仪器的
偏远农村地区。

3.4 重组酶辅助扩增
重组酶辅助扩增（RAA）是
一种等温核酸扩增技术，可以在恒
温下快速扩增靶基因片段，使用带
有相应抗体的试纸可以目视检测标
记有特定分子的扩增产物。

Chen
W等开发了RAA技术与核酸试纸
相结合（RAA试纸）的检测技术。

该试纸条可以检测到低至103拷
贝/μL含有PCV2 ORF2基因片段
的重组质粒，病毒DNA和病毒滴
度的最低检测限为6.7×10-6 ng/μL
和10 TCID
50
/mL，由于具有特异性
强、灵敏度高、重复性好、操作方法
简单等优点，所以PCV2 RAA试纸
适用于PCV2现场的快速临床检测。

3.5 原位杂交法
原位杂交法（ISH）是指用特
定标记的已知序列核酸为探针与细
胞或组织切片中核酸进行杂交，从
而对特定核酸序列进行精确定量定
位的过程。

Hansen MS等用原位杂
交法（ISH）检测PCV2的核酸，在
受PMWS影响的猪中，20头猪胸
腺样本中有19份检测结果为阳性，
阳性率为95%。

Baró J等在96头
患有肠道疾病并提交尸检的猪中，
72头猪通过原位杂交（ISH）显示
PCV2呈阳性，阳性率为75%。

3.6 其他分子生物学方法
光学表面等离子体共振（SPR）
免疫测定法是一种非破坏性、无标
记、实时的检测方法。

SPR是一种
物理光学现象，SPR信号随金属表
面折射率的变化而变化，通过SPR
角的生物反应过程的动态变化可以
获得生物分子相互作用的特定信
号。

Hu J等基于表面等离子体共振
（SPR）并建立了特殊的分子鉴定膜，
研究了一种灵敏且无标记的分析方
法，用于检测血清样品中PCV2。

SPR生物传感方法的理论检测限计
算为0.04 μg/mL。

相应地，回收率
从81.0%到89.3%不等，与PCV2
检测试剂盒相比，该表面等离子体
共振生物传感系统通过线性度、精
度和恢复率进行了验证，证明了表
面等离子体共振免疫测定是可靠和
稳健的。

4 免疫学检测
4.1 酶联免疫吸附测定
酶联免疫吸附测定（ELISA）
方法是利用抗原抗体之间专一性结
合的特性，通过特异性显色反应对
抗原或抗体进行检测。

该方法具有
特异性高、操作简便、耗时少、结
果便于观察等优点，目前被广泛
研究和应用。

常见的ELISA检测
方法有：间接ELISA，双抗夹心ELISA，竞争性ELISA。

4.1.1 间接ELISA
间接ELISA是用可溶性抗原包被于固相载体，洗涤，加入含有被测抗体的标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色，即可测出待测抗体的量。

栗利芳等建立了PCV2合成肽间接ELISA抗体检测方法。

试验通过对国内PCV2流行毒株的序列测定并结合猪圆环疫苗毒株序列，化学合成可能的抗原位点肽段，通过血清学试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到免疫原性较高的肽段，通过120份PCV2阳性血清筛选，选取出4条肽段混合作为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法。

进一步试验可见建立的间接ELISA方法敏感性为95.0%，特异性为97.5%，重复性稳定性好。

PCV2自然感染和疫苗免疫都产生PCV2 Cap抗体阳性的结果，因此它们无法诊断免疫猪场中的PCV2感染，CHEN Q等建立了一种非结构蛋白（Rep’蛋白）抗体检测方法，该方法可区分自然感染产生的抗体和疫苗免疫诱导的抗体。

4.1.2 双抗夹心ELISA
双抗夹心ELISA法是指将特异性针对待测抗原的抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入待测抗原与固相载体上的抗体结合，而后加入生物素化的针对待测抗原的抗体，形成夹心。

许兆君等建立了猪圆环病毒2型Cap蛋白双抗体夹心ELISA定量检测方法。

试验采用氯化铯密度梯度超速离心方法制备PCV2 Cap 蛋白标准品，用纯化的Cap蛋白免疫小鼠和家兔，分别获得特异性强的单克隆抗体和亲和力、敏感性较高的多克隆抗体，在此基础上建立了
双夹心ELISA定量检测PCV2 Cap
蛋白的抗原检测方法。

通过方阵试
验确定捕获抗体兔多抗和酶标单抗
最佳浓度都为1∶10 000，该方法
建立的标准曲线线性相关系数大于
0.99，定量检测上限为250 ng/mL，
下限为15.6 ng/mL，在此范围内的
检测结果可靠。

4.1.3 竞争性ELISA
竞争性ELISA是将特异性抗
体包被于固相载体表面，经洗涤后
分成2组：一组加酶标记抗原和被
测抗原的混合液，另一组只加酶标
记抗原，经孵育洗涤后加底物显
色，这2组底物降解量之差，即可
测定的未知抗原的量。

Mu Y等开
发了一种以纳米体（Nb）-辣根过
氧化物酶（HRP）融合蛋白为超敏
探针的竞争性ELISA（cELISA），
敏感性和特异性分别为99.68%和
95.92%，该方法是一种快速可靠、
低成本的基于纳米体的工具，可用
于当前PCV2疫苗疗效的血清学评
估和PCV2感染的间接诊断。

4.2 免疫层析试纸条
免疫层析是出现于20世纪
80年代初期的一种新型的，快速的
免疫分析方式。

将特异的抗体先固
定于硝酸纤维素膜的某一区带，当
该干燥的硝酸纤维素一端浸入待测
样品后，由于毛细管作用，样品将
沿着该膜向前移动，当移动到固定
有抗体的区域时，样品中相应的抗
原与该抗体发生特异性结合，用免
疫胶体金染色可使该区域显示一定
的颜色，从而实现特异性的免疫诊
断。

JIN Q等成功开发出胶体金标
记抗原探针的快速免疫层析试纸
条，应用于PCV2抗体的检测，通
过条带和商用ELISA试剂盒评估了
500个临床猪血清样品，免疫层析
试纸条与ELISA试剂盒的一致性为
94.00%。

该试纸可用作现场快速诊
断PCV2抗体的候选方法。

4.3 其他免疫学方法
单结构域抗体（sdAbs）和碱
性磷酸酶（AP）的融合已被证明可
用作免疫诊断试剂，psdAb-AP融合
效率高，需要更少的操作步骤，并
且能在短时间内结束测定。

Yang S
等描述了一种与碱性磷酸酶（AP）
融合的单结构域抗体（sdAbs）用
于检测PCV2，为了评估psdAb-AP
融合作为诊断试剂的实用性，将融
合用于蛋白质印迹（WB）、直接
ELISA和免疫细胞化学测定（ICC）。

结果表明，sdAbs与AP的融合为开
发更优质的免疫试剂提供了有价值
的途径，为PCV2检测提供了一种
简单，方便和灵敏的方法。

5 小结
PCV2引起的猪圆环病毒病的发
生对生猪生产有着重大影响，预防
和控制该类疾病对于最大限度地减
少经济损失至关重要。

PCV2的检测
技术数不胜数，其中病毒分离鉴定方
法因其耗时长，血清成本高等缺点不
适于常规检测。

电镜观察也因为电子
显微镜设备价格较高，难以与同种属
病毒区别等劣势同样不适于常规检
测。

目前，PCV2在分子生物学方面
的抗原检测方法研究较多，如PCR，
LMAP，RP A，RAA，ISH等；而免
疫学检测方法研究较少，如ELISA，
免疫层析等。

许多研究人员对常用的
抗原抗体检测方法以外的新型检测
方法做了一些探索，发表了一些具
备良好应用前景的PCV2检测鉴定方
法，但仍需继续发现更先进、更高效
的临床检测技术，为临床兽医科技工
作者建立快速、简便、准确、实用的
PCV2检测方法提供参考。

(收稿日期：2022-04-27）。