四环素类药物残留
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目前四环素类抗生素的含量测定方法有微生物法、高效毛细管区 带电泳法、薄层色谱法及高效液相色谱法、HPLC-MS/MS等。本实验 选择独特的样品处理方法，建立了一种快速、准确、分离度好的高效 液相色谱法。
色谱柱的选择
用于分离四环素类化合物的色谱柱种类较多，包括 C18 柱、C8 柱、ODS 柱、苯基柱等，考虑到四环素类 物质在水中溶解度很小，且分子量很小，正相键合相 和反相键合相均可使用，但由于其分子中含酚羟基和烯 酸型羟基，具有一定极性，若选用正相键合相色谱柱， 可能会由于正相键合相的极性很大，二者的作用力很 强，造成洗脱困难，保留时间过长的情况，所以，选 择反相键合相更为适宜。加之，四环素类药物分子中 含酚羟基和烯酸型羟基显弱酸性，同时含有二甲胺基显 碱性，为两性化合物，在一定 pH 值下可以解离，在 反相键合相的条件下，调节pH 值至合适范围，可获得 适宜保留值，达到满意分离。 本实验中选择了反相键合相色谱柱，并对C8 和C18 键 合相的分离能力进行了对比分析，结果表明C18 色谱柱 分离效果较好。这可能是由于C 1 8 色谱柱填料粒径小， 表面积大，柱效高，从而增强了溶质分子的分离度。加 之其有较高的 C 含量和更好的疏水性，对于各种类型的 样品分子具有更强的适应能力，所以在测定和分析禽产 品中四环素类药物多残留时可以优先考虑使用C18 作为 实验用柱。
• 式中，x为样品中抗生素含量，mg/kg,A为样品溶液测得的抗生素 质量，mg；m为样品质量，g。
这是在GB/T20764-2006中截取的标 准物质色谱图，用的是液相色谱-紫外检 测法。与书本所述方法有所区别，在这 列出作为参考，出峰顺序依次为土霉素、 四环素、金霉素。
参照GB/T60764-2006,GB/T21317-2007中 测定四环素类兽药残留的相关方法，为使 方法更为准确可靠，在原实验的基础上， 可以再做回收率及精密度试验
2）四环素在酸性水溶液中紫外270nm处有最大吸收。
3）不同ph值流动相条件下四环素类抗生素出峰效果不同，ph值越高，峰的拖 尾现象越严重。酸性增强，各峰间的分离度增大，峰形越对称，但是过低的ph 值会使填料柱水解，损坏柱子，故选用ph值2.5的乙腈与磷酸二氢钠溶液组成流 动相，具有较好的峰形。
样品预处理 将动物组织解冻，匀质，准确称取5.00g(±0.01g) 置于50ml追星瓶中，加入5%的高氯酸溶液25ml，于超声波振荡 器上振摇10min。以2000r／min高速离心3min，取上清液，经 0.45μm滤膜过滤，取10μL进样，从工作曲线上查得含量。
• 工作曲线 分别称取7份切碎的肉样，每份5.00g（精确到 ±0.01g）
• 分别加入混合标准溶液0.25μL、50μL、100μL、150μL、200μL、 250μL（含土霉素、四环素各0、2.5μg、5.0μg、10.0μg、 15.0μg、20.0μg、25.0μg）；按试样测定方法操作，以峰高为纵 坐标，抗生素含量为横坐标，绘制标准曲线。
• 结果计算 x= A
m
常用于临床的四环素类抗生素有：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等
来源 土霉素由龟裂链丝菌、四环素由黑白链丝菌、金霉素由金色链丝菌的培养液提 取而得，四环素还可用金霉素除去氯元素而获得。
性状类药物分为金黄色或黄色晶粉，无臭，味苦，易溶于水，遇光则色渐变暗，故须密封、 遮光，在干燥处保存。其水溶液的稳定性以四环素为佳，但一般均须以新鲜配制为宜， 如不能立即用完，应放于低温(4℃以下)处保存。
作用与用途 四环素、土霉素、金霉素及多四环素为四环素类兽医专用药,该类药物为广 谱抗生素，具有良好的抑菌效果，因其价格便宜，目前仍广泛应用于畜禽、水生生物等 产业领域。但由于不合理使用以及不遵守休药期(WDT)等，造成该类药物及其降解产物 残留于动物组织及畜产品中，必然会危及人类的健康。因此，为了控制四环素类药物在 动物性食品中的残留，欧盟、美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物的最大残留限 量为0.1mg/L。
回收率及精密度试验：分别向5mL空白样 品中添加混合标准溶液制成0.05、0.1、 0.2μg／ml 3种浓度的标准回收溶液，按上 述样品处理和色谱条件进行回收率及精密 度试验(每个添加做5个平行)
1）由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合，因此需要用强酸或酸 性脱蛋白剂从生物制品中提取。
参照gbt607642006gbt213172007中测定四环素类兽药残留的相关方法为使方法更为准确可靠在原实验的基础上可以再做回收率及精密度试验回收率及精密度试验分别向5ml空白样品中添加混合标准溶液制成0050102gml3种浓度的标准回收溶液按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验每个添加做5个平行1由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合因此需要用强酸或酸性脱蛋白剂从生物制品中提取
土霉素(0TC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)标 准储备液：准确称取0TC、TC、CTC 固体标 准品各0.0100g，0TC、TC用0.1mol/L盐酸溶 解定容至10.00mL，CTC溶于蒸馏水定容至 10.00mL。此三种标准储备液含量为1mg/mL (4℃下可保存一周)。 混合标准溶液：取0TC、TC标准储备液各 1.00mL，CTC标准储备液2.00mL，用蒸馏水 定容至1O ml，此混合标准液中OTC、TC含 量分别为100μg／ml（ppm），CTC含量为 200μg／ml（ppm） (当天配制当天使用)。 5%高氯酸溶液 0.01mol/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56g磷酸 二氢钠溶于100 mL水中，用30%硝酸调节PH 至2.5，经微孔滤膜过滤，超声备用。 乙腈 分析纯
色谱柱的选择
用于分离四环素类化合物的色谱柱种类较多，包括 C18 柱、C8 柱、ODS 柱、苯基柱等，考虑到四环素类 物质在水中溶解度很小，且分子量很小，正相键合相 和反相键合相均可使用，但由于其分子中含酚羟基和烯 酸型羟基，具有一定极性，若选用正相键合相色谱柱， 可能会由于正相键合相的极性很大，二者的作用力很 强，造成洗脱困难，保留时间过长的情况，所以，选 择反相键合相更为适宜。加之，四环素类药物分子中 含酚羟基和烯酸型羟基显弱酸性，同时含有二甲胺基显 碱性，为两性化合物，在一定 pH 值下可以解离，在 反相键合相的条件下，调节pH 值至合适范围，可获得 适宜保留值，达到满意分离。 本实验中选择了反相键合相色谱柱，并对C8 和C18 键 合相的分离能力进行了对比分析，结果表明C18 色谱柱 分离效果较好。这可能是由于C 1 8 色谱柱填料粒径小， 表面积大，柱效高，从而增强了溶质分子的分离度。加 之其有较高的 C 含量和更好的疏水性，对于各种类型的 样品分子具有更强的适应能力，所以在测定和分析禽产 品中四环素类药物多残留时可以优先考虑使用C18 作为 实验用柱。
• 式中，x为样品中抗生素含量，mg/kg,A为样品溶液测得的抗生素 质量，mg；m为样品质量，g。
这是在GB/T20764-2006中截取的标 准物质色谱图，用的是液相色谱-紫外检 测法。与书本所述方法有所区别，在这 列出作为参考，出峰顺序依次为土霉素、 四环素、金霉素。
参照GB/T60764-2006,GB/T21317-2007中 测定四环素类兽药残留的相关方法，为使 方法更为准确可靠，在原实验的基础上， 可以再做回收率及精密度试验
2）四环素在酸性水溶液中紫外270nm处有最大吸收。
3）不同ph值流动相条件下四环素类抗生素出峰效果不同，ph值越高，峰的拖 尾现象越严重。酸性增强，各峰间的分离度增大，峰形越对称，但是过低的ph 值会使填料柱水解，损坏柱子，故选用ph值2.5的乙腈与磷酸二氢钠溶液组成流 动相，具有较好的峰形。
样品预处理 将动物组织解冻，匀质，准确称取5.00g(±0.01g) 置于50ml追星瓶中，加入5%的高氯酸溶液25ml，于超声波振荡 器上振摇10min。以2000r／min高速离心3min，取上清液，经 0.45μm滤膜过滤，取10μL进样，从工作曲线上查得含量。
• 工作曲线 分别称取7份切碎的肉样，每份5.00g（精确到 ±0.01g）
• 分别加入混合标准溶液0.25μL、50μL、100μL、150μL、200μL、 250μL（含土霉素、四环素各0、2.5μg、5.0μg、10.0μg、 15.0μg、20.0μg、25.0μg）；按试样测定方法操作，以峰高为纵 坐标，抗生素含量为横坐标，绘制标准曲线。
• 结果计算 x= A
m
常用于临床的四环素类抗生素有：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等
来源 土霉素由龟裂链丝菌、四环素由黑白链丝菌、金霉素由金色链丝菌的培养液提 取而得，四环素还可用金霉素除去氯元素而获得。
性状类药物分为金黄色或黄色晶粉，无臭，味苦，易溶于水，遇光则色渐变暗，故须密封、 遮光，在干燥处保存。其水溶液的稳定性以四环素为佳，但一般均须以新鲜配制为宜， 如不能立即用完，应放于低温(4℃以下)处保存。
作用与用途 四环素、土霉素、金霉素及多四环素为四环素类兽医专用药,该类药物为广 谱抗生素，具有良好的抑菌效果，因其价格便宜，目前仍广泛应用于畜禽、水生生物等 产业领域。但由于不合理使用以及不遵守休药期(WDT)等，造成该类药物及其降解产物 残留于动物组织及畜产品中，必然会危及人类的健康。因此，为了控制四环素类药物在 动物性食品中的残留，欧盟、美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物的最大残留限 量为0.1mg/L。
回收率及精密度试验：分别向5mL空白样 品中添加混合标准溶液制成0.05、0.1、 0.2μg／ml 3种浓度的标准回收溶液，按上 述样品处理和色谱条件进行回收率及精密 度试验(每个添加做5个平行)
1）由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合，因此需要用强酸或酸 性脱蛋白剂从生物制品中提取。
参照gbt607642006gbt213172007中测定四环素类兽药残留的相关方法为使方法更为准确可靠在原实验的基础上可以再做回收率及精密度试验回收率及精密度试验分别向5ml空白样品中添加混合标准溶液制成0050102gml3种浓度的标准回收溶液按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验每个添加做5个平行1由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合因此需要用强酸或酸性脱蛋白剂从生物制品中提取
土霉素(0TC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)标 准储备液：准确称取0TC、TC、CTC 固体标 准品各0.0100g，0TC、TC用0.1mol/L盐酸溶 解定容至10.00mL，CTC溶于蒸馏水定容至 10.00mL。此三种标准储备液含量为1mg/mL (4℃下可保存一周)。 混合标准溶液：取0TC、TC标准储备液各 1.00mL，CTC标准储备液2.00mL，用蒸馏水 定容至1O ml，此混合标准液中OTC、TC含 量分别为100μg／ml（ppm），CTC含量为 200μg／ml（ppm） (当天配制当天使用)。 5%高氯酸溶液 0.01mol/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56g磷酸 二氢钠溶于100 mL水中，用30%硝酸调节PH 至2.5，经微孔滤膜过滤，超声备用。 乙腈 分析纯