小麦抗白粉病基因的分子标记及标记辅助育种研究进展

2001年3月河南农业大学学报Mar.2001
第35卷第1期
Journai of Henan Agricuiturai University
Voi !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
.35No.1
收稿日期：2000-07-19
基金项目：河南省自然科学基金资助项目（004012100）
作者简介：刘红彦（1964-），男，河南嵩县人，河南省农科院副研究员，博士，主要从事分子生物学研究.
文章编号：1000-2340（2001）01-0026-06
小麦抗白粉病基因的分子标记及
标记辅助育种研究进展
刘红彦，何文兰，杨共强，宋玉立
（河南省农科院植物保护研究所，河南郑州450002）
摘要：介绍了DNA 分子标记的主要种类及优缺点，综述了该项技术在小麦抗白粉病基因分子标记中的鉴定、基因定位、遗传图谱的构建，以及作为辅助选择手段在小麦抗白粉病育种中的应用进展.并分析了存在的问题及解决途径.关键词：小麦白粉病；抗病基因；分子标记；标记辅助育种中图分类号：S512.1
文献标识码：A
Advances in research on molecular markers linked with genes
for resistance to powdery mildew and application
to wheat marker-assisted breeding
LIU Hong-yan ，HE Wen-ian ，YANG Gong-giang ，SONG Yu-ii
（Institute of Piant Protection ，Henan Academy of Agricuiturai Sciences ，Zhengzhou 450002，China ）
Abstract ：An introduction is given of the major DNA moiecuiar marker technigues and advances in appiication to the
identification of moiecuiar markers iinked with genes for resistance to powdery miidew in wheat ，gene iocation ，genetic map construction and wheat marker-assisted breeding for resistance to powdery miidew.The existing probiems and their soiutions are anaiyzed.
Key words ：wheat powdery miidew ；resistance gene ；moiecuiar marker ；marker-assisted breeding
由专性寄生菌Blumeria graminis f.sp.tritici 引起的小麦白粉病是世界性病害.该病害在我国的发生也很普遍，尤以黄淮麦区发生危害最重.长期以来，抗病品种的选育和推广应用是控制白粉病危害的基本措施，但由于抗病基因利用的单一化和病菌毒性变异快，导致推广品种的抗性不断被新的毒性基因所克服，因而合理布局抗病基因，特别是选育具有多个抗病基因组合的持久抗性品种，有效控制小麦白粉病的危害，已成为共识.常规育种导入抗病基因成功与否，多是通过人工接菌来鉴定，这对于导入单个抗病基因是很有效的，但存在鉴定周期长、受环境条件影响大、操作繁琐等缺点，特别是导入多个抗病基因时，由于受鉴别小种的限制和基因间的掩盖，不能准确鉴定导入的是哪一个抗病基因及抗病基因的数量，导致选择过程中抗病基因丢失，难以达到预定育种目标.90年代以来，DNA 分子标记技术的发展完善，为解决这一难题开辟了一条途径.DNA 分子标记具有多态性很高，数量极大，显性或共显性遗传，检测方便、快捷、准确
等特点，因而在农作物抗病遗传和育种领域得到广泛的应用［1，2］.作者介绍了近10a 来DNA 分子标记技术在小麦抗白粉病基因分子标记鉴定、遗传作图及标记辅助育种等方面的研究进展.
1小麦抗白粉病基因的DNA 分子标记种类
在小麦抗白粉病基因分子标记研究中，常用的DNA 分子标记有RFLPs （Restriction Fragment Length Poiy-morphisms ，限制性片段长度多态性）、RAPDs
（Random Ampiified Poiymorphic DNAs ，随机扩增多态性DNA ）、
第1期刘红彦等：小麦抗白粉病基因的分子标记及标记辅助育种研究进展27
AFLPs（Ampiified Fragment Length Poiymorphisms，扩增片段长度多态性）、SSR（Simpie Seguence Repeats，简单序
分离群体、双单倍体列重复）等.鉴定标记所用的材料为近等基因系［3］（Near-isogenic iines，NIL）和由F
2
（Doubie hapioid，DH）或重组近交系（Recombinant reiated inbred iines，RIL）构建的DNA抗感池［4］.
1.1RFLP标记
RFLP技术是利用限制性内切酶，酶切不同生物个体基因组DNA，琼脂糖电泳后，转膜、变性处理，然后用一组放射性同位素（通常是32P）或非放射性物质（如地高辛、生物素等）标记的探针（常用随机的基因组克隆或cDNA克隆作探针）进行分子杂交，再通过放射自显影（或非同位素技术）观察酶切片段长度的差异.HARTL等最早于1993年以NIL为材料，用RFLP技术找到了1个与小麦抗白粉病基因Pm3b紧密连锁的RFLP标记［5］，此后又有学者陆续找到与Pm1，Pm2，Pm3b，Pm4a，Pm5，Pm6，Pm12，Pm13和Pm18连锁的RFLP标记［6~12］，对这些基因进行了更精确的定位.有些RFLP标记可转化成PCR标记—STS（Seguence tag-ging site），便于应用.
1.2RAPD标记
RFLP因技术复杂，使用放射性同位素，其普及应用受到限制.近几年，RAPD技术因具有操作简单，周期短，自动化程度高，不用同位素等优点，而得到广泛应用.该技术是采用一套随机核苷酸序列（通常为10个碱基）为引物，扩增基因组DNA，产生随机长度的DNA片断，获得的一种DNA标记，即RAPD标记［13］.该标记可经克隆测序、设计特异引物，转化为SCAR（Seguenced Characterized Ampiified Regions）标记.HARTL等利用F
分离群体构建的DNA池进行RAPD分析，鉴定到1个与Trigo BR34中的未知抗白粉病基因连锁距2
离为13cM的RAPD标记［8］.随后其他学者又鉴定出与Pm1，Pm2，Pm4a，Pm21和Pm25连锁的RAPD标记［14~19］.其中与Pm1和Pm21连锁的标记已转化为SCAR标记［14，18］.
1.3AFLP标记
AFLPs是荷兰科学家ZABEAU等1993年发明的一种DNA分子标记新技术，其基本原理是选择性扩增基因组DNA的限制性酶切片段，其方法是用限制性内切酶酶切基因组DNA，将特定的接头（adapter）与酶切的DNA片段连接，形成带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物的识别，特异性片段得到扩增，最后通过PAGE观察酶切片段的多态性［20］.可见AFLP实际上是一种RFLP和RAPD相结合的技术，既有RFLPs的可靠性，也有RAPDs的灵敏性.它的最大优点是多态性丰富，重复性好，通过变性PAGE可检测到的谱带多达50~100条，是一种十分理想和有效的遗传标记，能用于构建高清晰度的遗传图谱［21］.缺点是成本高，通常需要用同位素检测，也可以经硝酸银染色观察多态性.HARTL等利用AFLP技术对Rm4b进行分子作图，6个AFLP标记在染色体上的覆盖范围小于13cM［22］.
1.4SSR标记
SSR是基因组重复序列中的一种类型，又称微卫星DNA（Microsateiiite DNA）.重复单位很短，只有1~5bp，总长度为几十个bp，分布于整个基因组的不同位置上［23，24］.微卫星DNA两端的序列一般是相对保守的单拷贝序列，据此可通过设计特异引物进行SSR-PCR扩增来揭示微卫星DNA的多态性.其特点是多态性强，随机均匀地分布于整个基因组，可通过PCR快速检测分析，引物序列公开发表后，便能广泛交流使用.
2DNA分子标记的应用
2.1小麦抗白粉病基因分子标记的鉴定、基因定位和遗传图谱的构建
截止目前，在已报道的37个小麦抗白粉病基因中［8，25，26，27］，有16个基因位点鉴定出不同类型的DNA 分子标记，并进行了分子作图.例如，用6个AFLP标记构建了含有Pm4b的部分连锁图［22］.利用RFLP标记，将Pm12定位于易位染色体6BS-6SS.6SL的短臂上，并构建了部分遗传图谱［11］.但尚有21个基因没有标记（见表1）.
在进行分子标记鉴定、基因定位和遗传作图时，可以2种以上技术结合使用.KELLER等利用176个RFLP探针和9个小麦微卫星标记构建了包含23个连锁群（2469cM）、182个位点的遗传图谱，通过复合区间作图，检测到控制成株期白粉病抗性的18个OTL（guantitative trait ioci），解释77%的表型变异.2个主效OTL中，1个OTL来自Forno，位于7B上，认为代表已知的Pm5基因，另1个位于5A，来自斯卑尔脱小麦Oberkuimer，不同于任何已知Pm基因［25］.
28河南农业大学学报第35卷
表l小麦抗白粉病基因及与其连锁的分子标记
基因名称位点来源代表品种标记名称连锁距离/cM参考文献Pmla7AL普通小麦Axminster Xcdo3470［6］
Xwhsl78 2.812.7［8］
UBC3204200［l4］
UBC638550!SCAR5500［l4］
OPFl2650 5.41l.9［l4］Pmlb7A栽培—粒小麦Mocziatka
Pmlc7A栽培—粒小麦MlN
Pmld7A斯卑尔脱小麦TRI2258
Pm25DS普通小麦Maris Huntsman Xbcdl87l 3.5［6］
Xwhs295 2.712.6［8］
Xwhs350［8］
Xfba393［7］
OPI04l700l2.213.3［l5］Pm3a lAS普通小麦Asosan Xbcdl434［6］
Xwhsl79［5］Pm3b lA普通小麦Chui Xbcdl434l.3［6］
Xwhsl79 3.31l.9［5］Pm3c lA普通小麦Sonora
Pm3d lA普通小麦Koiibri
Pm3e lA普通小麦Wl50
Pm3f lA普通小麦Michigan Amber/8"Cc
Pm4a2AL栽培二粒小麦Khapii/8"Cc Xbcdl23l-2A（2）!STS l7000［6］［28］
Xcdo678-2A0［6］
Xbcdl23l-2A（l）l.5［6］
Xbcd292-2A l.5［6］Pm4b2AL波斯小麦Amarda Sl6Ml2/3l5［22］
Sl6Ml5/l59
Sl5M23/200
S2lM23/323
Sl9M23/l33
Sl7M20/l33
Pm57BL栽培二粒小麦Hope Xgik750［9］
Xpsr547
Xpsrl29
OTL7BL Forno Xgik7500.7［25］
Xgwmllla 3.7
Xpsr547 5.4
Xpsrl29ll.4
Pm62B提莫菲维小麦Timaien Xbcdl35ecoR!9kb l.61l.5［l0］
Xbcd307ecoR"8.8kb l.61l.5［l0］
Xbcd266ecoR!l8kb 4.812.6［l0］Pm74BS黑麦Transec
Pm8lB黑麦Kavkaz
Pm97AL普通小麦Normandie
Pml0lD普通小麦Norin4
Pmll6BS普通小麦中国春
Pml26BS拟斯卑尔脱山羊草Line3l Xpsr55l，Xpsrl0，［ll］
Xpsrl06，Nor2，
Xpsrl4l，Xpsrll3
Pml33D高大山羊草RlA Xutvl4［l2］Pml46B普通小麦Akabozu
Pml57DS普通小麦Norin4
Pml64A野生二粒小麦Norman iines
Pml7lA黑麦Amigo
Pml8普通小麦Weihenstephan MlN Xwhsl78 4.413.6［8］
第1期刘红彦等：小麦抗白粉病基因的分子标记及标记辅助育种研究进展29
续表1小麦抗白粉病基因及与其连锁的分子标记
基因名称位点来源代表品种标记名称连锁距离/cM参考文献
Pm普通小麦Trigo BR34OPH11190013
Pm197D方穗山羊草Syntheticxx186
Pm206BL黑麦KS93WGRC28
Pm217AS簇毛麦扬麦5/sub.6V OPH1719000［17］
OPH171400!SCAR12650［18］
SCAR1400
Pm221D普通小麦Virest
Pm235A普通小麦Line81-7241
Pm246D普通小麦Chiyacao
Pm251A栽培一粒小麦NC96BGTA5OPAG0495017.214.48［19］
OPX06105012.813.96［19］
OPAI1460021.614.88［19］OTL5A Oberkuimer Xpsr644a 1.1［25］
APR（成株期抗性）普通小麦Massey Xwms304
Xwms294
Xwg996
Xksu D22
17.9
12.3
9.2
7.7
［27］
注：APR的连锁距离用重组率（%）表示.
!"!抗白粉病基因的分子检测和标记辅助育种
分子标记用于抗病基因检测，不受环境、生长季节限制，周期短.在育种过程中，用作辅助选择手段，可以提高选择的准确性，缩小育种群体，结合加代技术，能大大缩短育种年限，提高育种效率.
刘金元等利用国外筛选到的与抗白粉病基因Pm2及Pm4a紧密连锁的RFLP标记，分析国内育成的小麦抗白粉病材料，发现即使在不同的遗传背景下，这些RFLP标记仍可用于对Pm2及Pm4a的鉴定［29］.
RFLP标记的突出优点是重复性好，稳定可靠，但技术复杂，成本高，使用同位素，在小麦育种实践中要检测大量群体，这是不现实的，需要转化为方便易用的STS标记.RAPD标记虽检测方便，但稳定性差，所以应通过克隆测序转化为SCAR标记，以提高检测的稳定性和实用性.Mohier等转化成的STS标记，检测Pm2的有无［30］.刘金元等将Pm4a的共分离RFLP标记Xbcd1231-2A转化为STS标记，在11个已知含有Pm4a基因的小材料中均扩增出此标记，而在不含有Pm4a的小麦材料中未扩增出此标记，初步认为该标记可用于Pm4a基因的跟踪检测［28］.Pm21来自簇毛麦的抗白粉病基因，抗目前已知所有生理小种，具有重要
的应用价值，刘志勇等将与其连锁的RAPD标记OPH17
1400转化为SCAR
1265
和SCAR
1400
，用于“滚动式加代回
交转育”中Pm21的检测，现已获得许多具有不同遗传背景、农艺性状优良的抗白粉病品系［18］.利用不同基因的分子标记，已成功地将Pm2+Pm4a，Pm2+Pm21和Pm4a+Pm21基因组合导入感病品种扬158［31］.河南是小麦种植大省，白粉病常年都有发生，而当前推广的品种绝大多数是感病品种，因此作者着手利用现有的分子标记，开展标记辅助育种工作，将Pm2，Pm4a，Pm21等抗病基因导入豫麦13、豫麦18和豫麦49等感病品种，争取在短期内选育出高产抗病品种.
#存在的问题及解决途径
1）目前鉴定到的标记大多数为RFLP标记，实用性差，应尽快将连锁程度高的RFLP标记，转化为STS 标记，便于在小麦抗病育种实践中应用.
2）标记数量少，完全连锁的标记少，互斥相标记少，影响基因检测的准确性.因此应增加紧密连锁标记的数量，特别是互斥相标记和共显性标记.同时采用多个标记，才能准确检测基因，提高间接选择效率.
3）已完成的分子标记鉴定工作主要集中在Pm2，Pm4a，Pm6和Pm21等几个抗性比较好的基因上，其它抗性好的基因如Pm16，Pm17，Pm20和Pm24等尚没有标记，而且忽视了对一些小种已丧失抗性的基因，如Pm3，Pm5，Pm7，Pm8，Pm9等.这些抗性差的基因虽无法单独利用，但可以与其它抗性较好的基因组合使用，拓宽抗性谱，这种基因组合在其它作物上已有成功的例子.在检测这些基因时，分子标记将起重要作
30河南农业大学学报第35卷
用.所以，从多基因布局和综合利用角度考虑，抗性差的基因，仍需要鉴定其分子标记.
综上所述，完成所有小麦抗白粉病基因分子标记的鉴定，构建具有众多完全连锁的、不同连锁相的及共显性的分子标记体系，对于大量品种资源系统开展抗白粉病基因的分子检测，及通过分子标记辅助选择手段选育持久抗病品种，实现小麦白粉病的长期有效控制及小麦生产的可持续发展，具有长远、重要的经济意义.
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