转基因红花中角质细胞生长因子KGF1的表达

６．ＢＡ＋０．５ ｍｇ・Ｌ一１ １．２．７
性对照。用ＫｐｎｌｌＢｇｌＩＩ酶切总ＤＮＡ，并以ＰＣＲ扩增获 得的ＫＧＦ－１片段为探针．４２。Ｃ杂交过夜，显色，分析 杂交信号。
ＲＴ．ＰＣＲ检测
取潮霉素抗性苗及ＰＣＲ多次鉴定为阳性植株的新鲜 叶片约２００ ｍｇ，采用改进的异硫氰酸胍法（１ｉＰＴｄｚｏｌ 法）提取红花总ＲＮＡ。总ＲＮＡ样品浓度用ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００超微量分光光度计（购自Ｔｈｅｒｍｏ公司）测定。将 ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ（详见Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ
ｃｕｔｔｉｎｇ ｓｉｔｅ Ｐ１ Ｋｐｎｌ
ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ和
ｅ吣瓯ＧＣＡＡＣＧⅪ瓯Ｇ吣
ＴＣＣＡ Ｐ２
Ｐｌｕｓ等均购自日本ＴａＫａＲａ公司。ＤＮＡ ＧｅＩ Ｋｉｔ和质粒小提试剂盒等购自北京艾德莱
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ＡＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣⅡ：△ＡＧ
ＴＡＡＴＡＧＣＣＡＴｌ．ＧＧ
ｐＬ。ＰＣＲ反应程
序为：９４。Ｃ预变性５分钟：９４。Ｃ变性４５秒，６４。Ｃ退火 ４５秒，７２。Ｃ延伸４５秒，３０个循环；７２。Ｃ延伸１０分钟。 ＰＣＲ扩增产物经１％核酸琼脂糖凝胶电泳后，在ＤＮＲ
Ｂｉｏ Ｉｍａｇｉｎｇ
１６。Ｃ过夜连
Ｓｙｓｔｅｍｓ（购自以色歹ＩＪＤＮＲ成像系统有
接。连接产物采用热激法转化Ｅ 裂解法提取质粒（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ
ａ１．，２００９），其药代动力学与药效学实验
结果与美国利用大肠杆菌表达胰岛素基因生产的重 组ＤＮＡ人胰岛素基本相同。２０１ ０年，ＳｅｍｂｉｏＳｙｓ公司 向美国ＦＤＡ提出做川期临床的申请。通过转基因红花 生产胰岛素工艺简单、成本低且产量高，可为糖尿病 患者提供廉价的胰岛素来源（徐铮奎，２０１０）。
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ、Ｔ４ ＲＮＡｉｓｏ ＤＮＡ
和Ｐ２（浓度均为１０ ｐｍｏｌ・Ｌ一１）各１ ＵＬ，模板１
ＩＪＬ，
ｄｄＨ２０ ３７．６５ ｐＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４。Ｃ预变性５分 裹１引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒ｛ｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｐｎｍｅｒｓ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５。－３。）
ＧＧＧＧＴＡＣ－
Ｂｇｌｌｌ
生物科技有限公司。ＰＣＲ弓Ｉ物合成及测序由北京六合
万方数据
江莺等：转基因红花中角质细胞生长因子ＫＧＦ一１的表达３１３
钟：９４。Ｃ变性４０秒，６４。Ｃ退火４０秒，７２。Ｃ延伸４０秒， ３０个循环：７２。Ｃ延伸１０分钟。用ＰＣＲ回收试剂盒回收 ＫＧＦ．１茂段ｏ
基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取总ＤＮＡ，以未转基因的 新鲜叶片作为阴性对照。ＰＣＲ扩增目的基因反应总体 系如下：
ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ，
１９８５）提取转基因红花总ＤＮＡ。以非转基因红花为阴 １．２．４无菌苗的培养及农杆菌介导的红花转化 用０．１％的氯化汞消毒新疆裕民无刺红花种子表面。 无菌水冲洗，浸泡过夜。次日播种于种子萌发培养基 上，２５。Ｃ暗培养３天，待用。 培养基配方如下：种子萌发培养基为ＭＳ＋３％蔗 糖＋０．７５％琼脂粉：子叶共培养基为ＭＳ＋Ｉ．５ ｍｇ・Ｌ－１
江莺，刘秀明，马吉胜，李巍，朱海林，杜美丽，李海燕，李校蕉（２０１１）．转基因红花中角质细胞生长因子ＫＧＦ－１的表达．
植物学报４６。３１１－３１８．
近年来。植物生物反应器以其生产成本低、安全、 易规模化生产等优点，为世界科学研究的发展创造了 新的机遇。Ｒｙｂｉｃｋｉ（２００９）认为植物比细菌、酵母（或 昆虫）和哺乳动物细胞等反应器系统更有开发潜力。 植物表达的大量重组蛋白已经进行临床试验，其中少 数已经市场化生产。自从１９８６年转基因植物被批准进 入田间试验，到１９９７年１月３１日。据美国农业部动植 物检疫局（ＡＰＨＩＳ）的统计数据，美国已批准的转基因 植物田间试验达２ ５８４例。Ｃａｌｇｅｎｅ公司研制的延熟番 茄ＦＬＡＶＲＳＡＶＲＴＭ于１９９４年被批准商业化。截止 １９９７年１月３１日。被批准商业化的转基因植物美国有 １７例，加拿大１８例，澳大利亚４例，日本７例。我国也 于１９９７年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化（贾 士荣，１９９７）。２００１年，我国已有１０余种转基因植物进 入田间试种，有６种转基因植物被批准商品化生产（沈 桂芳等，２００１ ｏ到２００５年，抗虫棉、耐贮番茄等基因 已转入几乎所有主要的粮食和饲料作物，涉及各类基 因１００多种。有３０余项在我国已经被批准商品化生产 （李轶女等，２００６）。 红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）为菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ） 一年生草本植物，又名川红花、刺红花（榕嘉，２００２）。
收稿日期：２０１０—１２—０１；接受日期：２０１ １－０１．２４
红花是油药两用作物，干燥管状花是一味常用中药， 性辛、温，具有活血通络、祛瘀止痛的功效。红花含 有丰富的红花黄色素和少量的红色素，是一种天然的 食用色素。红花籽油中亚油酸是高级烹饪油且广泛用 于医药和化工工业。目前红花组织培养有器官发生途 径和体细胞胚途径。利用器官发生途径形成红花再生 植株包含２种方式，一种是器官发生直接途径。即在 外植体上直接分化出芽：另一种是器官发生间接途 径，即外植体先形成愈伤组织，再进行芽的分化（李 爱新等，２００６；Ｒａｄｈｉｋａ
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＮＡＡ３％蔗糖＋０．７５％琼脂粉：愈伤
ｍｇ・Ｌ－。６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ・Ｌ－１
ｕ
Ｌ，
１．１．１植物材料及质粒和菌种 新疆裕民无刺红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ
ｔｉｎｃｔｏｎｕｓ
其中Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ０．２５ ｐＬ。１ ０ｘ Ｌ．）Ｆｈ本实
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ ５ ｐＬ，２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ－。ｄＮＴＰ ４ ｐＬ。Ｐ１
验室提供。质粒ｐ１３９０ｒ（３５Ｓ启动子）和ＰＵＣｌ９－ＫＧＦｌ、 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｈ）ＤＨ５ａ及根癌农杆菌（ＬＢＡ－ ４４０４）均为本实验室保存。 １．１．２酶和试剂 限制性内切酶Ｋｐｎｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ
基金项目：８６３计划（Ｎｏ．２００７ＡＡｌ００５０３）、吉林省科技发展计划重点项目（Ｎｏ．２００７０９２２）和高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目
（Ｎｏ．７０Ｓ０１ ８）
。通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｙｌｉ９９＠１６３．ｃｏｒｎ；ｘｉａｏｋｕｎｌｉ＠１６３．ｎｅｔ
万方数据
３１２植物学报４６（３）２０１１
１０
ｍｇ－Ｌ－１潮霉素（Ｈｙｇ）的子叶共培养基上培养。实
验重复２次，不同浓度潮霉素培养基每次做６个重复， 每个重复中含有１０个外植体。于自然光下观察４周． 观察不同浓度的潮霉素对红花子叶的影响。
１．２．２
ＫＧＦ．１基因的获得
以ＫＧＦ－１片段的ｃＤＮＡ植物偏好序列为基础，用
Ｐｒｉｍｅｒ
５．０软件设计合成特异性上下游引物Ｐ１、Ｐ２。
其中上游引物含有Ｋｐｎｌ酶切位点（表１斜体部分）和起 始密码子ＡＴＧ。下游引物含有Ｂｇｌｌｌ酶切位点（表１斜体
部分）和终止密码子Ｗ姨。引物序列见表１。
１材料与方法
１．１
通过梯度ＰＣＲ获得最佳退火温度为６４。Ｃ。以质 粒ＰＵＣｌ９．ＫＧＦｌ为模板，Ｐ１、Ｐ２为上下游引物，扩增
实验材料
得到５１５ ｂｐ的ＫＧＦ－１片段。反应体系总体积为５０
２ｘＰｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ １０ ｐＬ，Ｐ１ ｐＬ，ｄｄＨ２０ ８
和Ｐ２各０．５ ＵＬ，模板１ １．２．３重组表达质粒的构建 将质粒ｐ１３９０ｒ及ＫＧＦ一１的ＰＣＲ回收产物同时用Ｋｐｎｌ 和Ｂｇ『¨酶切，经１％核酸琼脂糖凝胶电泳及ＤＮＡ回收 试剂盒回收纯化后，用Ｔ４
ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ｃｏｉｌ
ＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自北京百泰克
Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ
生物技术有限公司。ＤＩＧ Ｈｉｇｈ
ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ ｌ购自美国Ｒｏｃｈｅ公司。细
胞分裂素（６一ＢＡ）、生长素（ＮＡＡ）、卡那霉素（Ｋａｍ）、 链霉素（Ｓｔｒ）和利福平（Ｒｉｆ）等购自美ｍ Ｓｉｇｍａ公司。乙 酰丁香酮（ＡＳ）购自日本Ｗａｋｏ公司。头孢曲松钠（Ｃｅｆ） 和羧苄西林钠（Ｃａｒｂ）购自哈尔滨制药股份有限公司。 潮霉素（Ｈｙｇ）购自Ｂｏｅｈｎｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ公司。其它常 规试剂均为国产或进口分析纯试剂。 １．２实验方法 １．２．１潮霉素敏感性实验 待红花种子发芽后，将子叶外植体先置于共培养基上 暗培养３天，然后转至分别含有０、２、４、６、８、
角质细胞生长因子（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ。
华大基因科技股份有限公司完成。植物基因组提取试 剂盒、２ｘＰｏｗｅｒ Ｔａｑ
ＰＣＲ
ＫＧＦ）是Ｒｕｂｉｎ等从胚胎肺成纤维细胞培养上清中发 现的，为ＦＧＦ家族成员，ＩｉＰＦＧＦ－７（宗宪磊等，２００９）。 ＫＧＦ．１由间质细胞产生，通过旁分泌机制分泌，与上 皮细胞上的特异性受体结合，与上皮创伤愈合、胚胎 发育、肿瘤形成与发展及免疫重建关系密切。ＫＧＦ．１ 是一种特异性的有效促进细胞增殖的生长因子。在损 伤修复过程中可大量诱导表达，促进上皮细胞的增 殖、迁移及分化，而且又能加强皮肤毛囊和皮脂腺的 前体细胞增殖和分化。ＫＧＦ－１在美容行业可以促进毛 发再生，消除皱纹。２００６年，采用农杆菌介导的转基 因方法。苏勇波（２００６）获得了人角质细胞生长因子的 水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）及胡萝卜（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）转化植 株。经过ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测证明了 人角质细胞生长因子基因已经整合到转基因植株的 基因组中，并表达了相应的蛋白。张国广等（２０１０）在 水稻中成功表达了角质细胞生长因子基因。 药油两用作物红花作为一种植物生物反应器来 生产医药用蛋白。上游生产成本低廉、安全。其可食 用性使得下游加工费用低，易规模化生产，因此被广 泛应用（Ｒｙｂｉｃｋｉ。２００９）。本实验利用根癌农杆菌ＬＢＡ－ ４４０４介导的方法在植物红花中表达ＫＧＦ－１。既优化 了红花的再生体系。又表达了外源蛋白。这种高效的 植物生物反应器系统可以更好地发掘红花的生产潜 力。具有十分重要的经济意义和商业价值。