病毒纯化与分析PPT课件
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新冠病毒的病毒纯化与结构分析
新冠病毒的病毒纯化与结构分析新冠病毒（SARS-CoV-2）的病毒纯化与结构分析新冠病毒（SARS-CoV-2）是一种引起严重急性呼吸道综合征冠状病毒（SARS）的病原体。
自该病毒爆发以来，全球各地的科学家们努力进行病毒的病毒纯化与结构分析，以揭示其病原性和传播机制，为疫苗和药物的开发提供重要的依据。
病毒纯化是一项关键的步骤，旨在从复杂的样本中分离和纯化出目标病毒。
对于新冠病毒的研究而言，从感染患者的呼吸道样本中分离病毒是首要任务。
这可以通过多种方法实现，包括细胞培养、核酸提取和机械切碎等。
其中，细胞培养是最常用的方法之一。
科学家们使用特定类型的细胞株，如Vero E6细胞，来培养新冠病毒。
一旦病毒感染细胞后，可以通过离心和滤过等步骤来收集和纯化病毒颗粒。
此外，分子生物学技术也被广泛应用于新冠病毒的纯化过程，如核酸提取和PCR （聚合酶链反应）。
纯化后的新冠病毒可用于进一步的研究，如病毒的结构分析。
结构分析可以提供对病毒形态和蛋白质组成的详细了解，这对于了解病毒的功能和与宿主细胞的相互作用至关重要。
在新冠病毒的研究中，常用的结构分析方法包括电子显微镜和X 射线晶体学。
电子显微镜（EM）是一种强大的工具，可以直接观察到病毒的形态和结构。
通过将纯化的新冠病毒样本制备成超薄冰冻层，并在电子显微镜下进行观察，可以获得高分辨率的病毒图像。
这些图像可以用于确定病毒的外形、大小和表面骨架等特征，从而提供关于病毒的重要信息。
X射线晶体学是另一种常用的结构分析方法，通过研究病毒蛋白在结晶状态下的X射线衍射图像，可以确定病毒蛋白的三维结构。
这种方法在新冠病毒研究中已经取得了重要突破。
例如，科学家们通过X射线晶体学确定了新冠病毒的主要蛋白，如刺突蛋白（S蛋白）和核糖核酸酶（RNA酶），的结构。
这些结果为疫苗和药物设计提供了重要的依据。
除电子显微镜和X射线晶体学外，还有其他一些结构分析方法被应用于新冠病毒研究。
例如，质谱分析可用于研究病毒蛋白的修饰和组成。
病毒纯化与分析
01
02
03
病毒的致病机制
研究病毒如何与宿主细胞 相互作用，导致疾病的发 生和发展，有助于深入了 解病毒的致病性。
病毒的宿主范围
研究病毒在不同宿主细胞 中的复制和传播能力，有 助于确定病毒的宿主范围 和传播途径。
病毒变异
研究病毒的基因组变异和 进化，有助于了解病毒的 变异规律和演化趋势，为 预防和治疗提供依据。
病毒的疫苗研究
疫苗靶点筛选
通过分析病毒的抗原结构和免疫原性，确定疫苗的靶点，为疫苗 设计和研发提供依据。
疫苗免疫效果评估
通过分析免疫后机体的免疫应答和保护效果，评估疫苗的有效性 和安全性。
疫苗生产工艺优化
通过对疫苗生产工艺的研究和改进，提高疫苗的生产效率和产品 质量。
病毒的抗病毒药物研究
药物靶点筛选
高通量分析
高通量测序和质谱技术的结合将使病毒基因组和蛋白质组的分析更加快 速和准确，有助于更全面地了解病毒的变异和进化。
03
临床应用拓展
随着病毒纯化与分析技术的不断完善，其在临床诊断、治疗和药物研发
中的应用将更加广泛，有助于提高病毒性疾病的诊断准确率Biblioteka 治疗效果。对抗病毒的挑战与机遇
挑战
病毒变异和进化速度快，导致病毒的检测和防治难度增加；同时，病毒性疾病 的诊断和治疗仍存在许多难点，如缺乏特效药物和疫苗。
通过分析病毒的生命周期和复制过程，确定药物的靶点，为药物设 计和研发提供依据。
药物效果评估
通过分析药物对病毒复制和感染的影响，评估药物的有效性和安全 性。
药物生产工艺优化
通过对药物生产工艺的研究和改进，提高药物的生产效率和产品质量。
05 结论
病毒纯化与分析的未来发展方向
病毒纯化与分析
• Solutions are isoosmotic: virus density is low
• Solutions have low viscosity: rapid sedimentation of virus particles
• Is non-toxic to cells • Has little or no effect on virus infectivity • Cells can be re-infected and electrophoresis
• Solutions are viscous: slow sedimentation of virus particles
• Highly toxic to cells: must be dialyzed prior to re-infection of cells
OPTIPREP – NO PROBLEMS
1.18
1.18
1.26
1.22
1.18
1.16
Effect of medium on PM2 infectivity
1.1 1.3 1.5 1.7 CsCl g/ml
Infectivity
Iodixanol 1012
Glycerol
1011
Sucrose
CsCl
0 10 20 30 40 50 60 % iodixanol, sucrose, glycerol
Index • Click on the virus of interest
• Sterile solution • CsCl/sucrose solutions require lengthy
preparation times and sterilization • CsCl is expensive
• Solutions have low viscosity: rapid sedimentation of virus particles
• Is non-toxic to cells • Has little or no effect on virus infectivity • Cells can be re-infected and electrophoresis
• Solutions are viscous: slow sedimentation of virus particles
• Highly toxic to cells: must be dialyzed prior to re-infection of cells
OPTIPREP – NO PROBLEMS
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Effect of medium on PM2 infectivity
1.1 1.3 1.5 1.7 CsCl g/ml
Infectivity
Iodixanol 1012
Glycerol
1011
Sucrose
CsCl
0 10 20 30 40 50 60 % iodixanol, sucrose, glycerol
Index • Click on the virus of interest
• Sterile solution • CsCl/sucrose solutions require lengthy
preparation times and sterilization • CsCl is expensive
病毒的纯化和检测ppt课件
病毒的纯化和检测
12
• 2.50%组织细胞感染量 (TCID50)测定法
该方法是测定病毒能使50%的组织培养细 胞发生感染的最小量。一般是将病毒悬 液作10倍的系列稀释，分别接种细胞， 经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等 指标，以最高稀释度能感染50%细胞的 量为终点。最后用统计方法计算出50% 组织细胞感染量。
病毒的纯化和检测
13
三、病毒感染的血清学诊断
•
原理是用已知病毒抗原来检测病人血
清中有无相应抗体，故须待病人感染后体
内产生抗体时才能检出。
•
另外，在采取临床标本及病人血清应
注意病程，必须采取患者急性期血清与恢
复期血清 (双份血清) 进行血清学试验。若
第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，
病毒的纯化和检测
• 病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方 法；
• 对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分级分离的技术。
病毒的纯化和检测
4
四、病毒萃取液的分级纯化
• 沉淀法 ➢中性盐沉淀法
➢有机溶剂沉淀法
• 离心法
➢聚乙二醇沉淀法 ➢等电点沉淀法
➢差速离心法 ➢密度梯度离心法 速率区带离心法
等密度区带法
② 有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于细胞膜，可使 邻近的细胞相互融合，形成多核巨细胞或称融合细胞。
③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养细胞中 形成胞浆或核内的包涵体。
• 2.红细胞吸附 (hemadsorption,HAd)
• 流感或副流感病毒等感染细胞后，由于细胞膜上出现了血
病毒感染的纯化与诊断
第一节 病毒的纯化
一、病毒纯化前的准备工作 繁殖病毒
华中农业大学病毒学实验技术第六章病毒纯化(XXXX).pptx
第六章 病毒的纯化
利用各种物理、化学方法，以不使 病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细 胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓 缩的病毒样品。
✓病毒微细结构的研究 ✓病毒抗原蛋白的分离纯化 ✓病毒化学成分及其遗传物质的研究 ✓病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
➢ 保持感染性 ➢ 具有均一性：大小、形态、密度、化学组成、
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特
点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适 宜的纯化方法。 4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯 1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后 收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材 料。
2．病毒提纯浓缩 ✓去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min
多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒 皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病 毒，在大于50nm的病毒）
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径 大于50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入 1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中， 而鱼精蛋白仍然沉淀。
离心30min，收集上清液。 ✓硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃ 5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭 菌ddH2O悬浮。 ✓透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或 PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次， 第5次透析过夜。
（二）层析法
✓葡聚糖柱层析法 ✓凝胶层析法 ✓离子交换柱层析法 ✓亲和层析法
（三）两相溶剂间分配系数法 原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同 而选择性地分配于其中的一方。 常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds)
利用各种物理、化学方法，以不使 病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细 胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓 缩的病毒样品。
✓病毒微细结构的研究 ✓病毒抗原蛋白的分离纯化 ✓病毒化学成分及其遗传物质的研究 ✓病毒感染的分子细节的研究
一、病毒纯化的标准
➢ 保持感染性 ➢ 具有均一性：大小、形态、密度、化学组成、
3、根据具体情况选择提纯方法 根据需要纯化的病毒的性质、起始材料的特
点、研究的目的以及实验室的条件等，选择适 宜的纯化方法。 4、建立灵敏的病毒鉴定和测定方法
六、伪狂犬病毒的浓缩提纯 1、病毒材料
将伪狂犬病病毒接种于PK-15细胞，病变后 收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材 料。
2．病毒提纯浓缩 ✓去细胞碎片及杂质：将细胞培养物4℃ 3000r/min
多数病毒的等电点在pH4.０~5.5之间。
5、皂土法
轮状病毒 皂土在酸性条件下（pH4~4.5)可吸附轮状病 毒，在大于50nm的病毒）
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质（直径 大于50nm ）共沉淀的作用，当向这种沉淀物加入 1mol/L NaCl时，其它蛋白质又重新释放到悬液中， 而鱼精蛋白仍然沉淀。
离心30min，收集上清液。 ✓硫酸铵沉淀：按100ml病毒液42.5g硫酸铵的量加入
硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜，4℃ 5000r/min离心40min，去上清，沉淀用适量的灭 菌ddH2O悬浮。 ✓透析：将悬浮的病毒液装于透析袋中，于ddH2O或 PBS中搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次， 第5次透析过夜。
（二）层析法
✓葡聚糖柱层析法 ✓凝胶层析法 ✓离子交换柱层析法 ✓亲和层析法
（三）两相溶剂间分配系数法 原理：溶质在两个互不相溶的溶剂中分配系数的不同 而选择性地分配于其中的一方。 常用的溶剂：葡聚糖硫酸盐（dextran sulphate, Ds)
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• Infectivity recoveries are 10-100x greater in iodixanol than in sucrose
8
rAAV in discontinuous gradient (V04)
Zolotukhin S. et al (1999) Gene Therapy, 6, 973-985
• Solutions are viscous: slow sedimentation of virus particles
• Highly toxic to cells: must be dialyzed prior to re-infection of cells
4
OPTIPREP – NO PROBLEMS
1.14
1.18
1.18
1.26
1.22
1.18
1.16
6
Effect of medium on PM2 infectivity
1.1 1.3 1.5 1.7 CsCl g/ml
Infectivity
Iodixanol 1012
Glycerol
1011
Sucrose
CsCl
0 10 20 30 40 50 60 % iodixanol, sucrose, glycerol
• Solutions have very high osmolality: viruses lose water; high virus density; high [CsCl] required for gradients
• Highly toxic to cells: must be dialyzed prior to re-infection of cells
Virus purification and analysis using OptiPrep™ - competitive
media
• Sucrose • Glycerol • Caesium chloride
1
SOLUTION HANDLING
• Density solutions prepared by diluting OptiPrep™ with culture medium or any balanced salt solution (Application Sheet V01)
Virus fluid 15% iodixanol
in 1 M NaCl 25% iodixanol
40% iodixanol
54% iodixanol
350,000g 1 h
proteins adenovirus rAAV
9
rAAV in continuous gradient (V04)
Hermans, W.T.J.M.C. et al (1999) Human Gene Therapy, 10, 1885-1891
• Solutions are isoosmotic: virus density is low
• Solutions have low viscosity: rapid sedimentation of virus particles
• Is non-toxic to cells • Has little or no effect on virus infectivity • Cells can be re-infected and electrophoresis
Virus fluid
OptiPrep
B
Gradient Master 10
Gradient Master profiles from 10% and
40% iodixanol at 80°and 20 rpm: effect of
Density (g/ml)
time
1.11
1.09
1.07
1
3
5
7
9
Fraction Number
11
3 Formats for separation of particles according to their density
1
2
3
12
rAAV in continuous gradient (V04)
Hermans, W.T.J.M.C. et al (1999) Human Gene Therapy, 10, 1885-1891
• Solutions ionic and corrosive: samples must be dialyzed before electrophoresis or HPLC
3
SUCROSE PROBLEMS (I)
• Solutions are hyperosmotic: virus density in sucrose usually higher than in iodixanol
and HPLC performed without dialysis
5
Virus banding density
Virus Epstein-Barr Semliki Forest
Poliovirus Measles
CsCl 1.26 1.26 1.34 1.21
Sucrose Iodixanol
• Sterile solution • CsCl/sucrose solutions require lengthy
preparation times and sterilization • CsCl is expensive
2
CsCl PROBLEMS
• Big losses in viral infectivity; low recoveries; high particle:infectivity ratios
Kivela et al (1999)Virol. 262, 364-374
7
SUCROSE PROBLEMS (II): for enveloped viruses,
particularly retroviruses
• Sucrose gradients cause loss of virus surface glycoproteins; no loss with iodixanol gradients
8
rAAV in discontinuous gradient (V04)
Zolotukhin S. et al (1999) Gene Therapy, 6, 973-985
• Solutions are viscous: slow sedimentation of virus particles
• Highly toxic to cells: must be dialyzed prior to re-infection of cells
4
OPTIPREP – NO PROBLEMS
1.14
1.18
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1.26
1.22
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Effect of medium on PM2 infectivity
1.1 1.3 1.5 1.7 CsCl g/ml
Infectivity
Iodixanol 1012
Glycerol
1011
Sucrose
CsCl
0 10 20 30 40 50 60 % iodixanol, sucrose, glycerol
• Solutions have very high osmolality: viruses lose water; high virus density; high [CsCl] required for gradients
• Highly toxic to cells: must be dialyzed prior to re-infection of cells
Virus purification and analysis using OptiPrep™ - competitive
media
• Sucrose • Glycerol • Caesium chloride
1
SOLUTION HANDLING
• Density solutions prepared by diluting OptiPrep™ with culture medium or any balanced salt solution (Application Sheet V01)
Virus fluid 15% iodixanol
in 1 M NaCl 25% iodixanol
40% iodixanol
54% iodixanol
350,000g 1 h
proteins adenovirus rAAV
9
rAAV in continuous gradient (V04)
Hermans, W.T.J.M.C. et al (1999) Human Gene Therapy, 10, 1885-1891
• Solutions are isoosmotic: virus density is low
• Solutions have low viscosity: rapid sedimentation of virus particles
• Is non-toxic to cells • Has little or no effect on virus infectivity • Cells can be re-infected and electrophoresis
Virus fluid
OptiPrep
B
Gradient Master 10
Gradient Master profiles from 10% and
40% iodixanol at 80°and 20 rpm: effect of
Density (g/ml)
time
1.11
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Fraction Number
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3 Formats for separation of particles according to their density
1
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rAAV in continuous gradient (V04)
Hermans, W.T.J.M.C. et al (1999) Human Gene Therapy, 10, 1885-1891
• Solutions ionic and corrosive: samples must be dialyzed before electrophoresis or HPLC
3
SUCROSE PROBLEMS (I)
• Solutions are hyperosmotic: virus density in sucrose usually higher than in iodixanol
and HPLC performed without dialysis
5
Virus banding density
Virus Epstein-Barr Semliki Forest
Poliovirus Measles
CsCl 1.26 1.26 1.34 1.21
Sucrose Iodixanol
• Sterile solution • CsCl/sucrose solutions require lengthy
preparation times and sterilization • CsCl is expensive
2
CsCl PROBLEMS
• Big losses in viral infectivity; low recoveries; high particle:infectivity ratios
Kivela et al (1999)Virol. 262, 364-374
7
SUCROSE PROBLEMS (II): for enveloped viruses,
particularly retroviruses
• Sucrose gradients cause loss of virus surface glycoproteins; no loss with iodixanol gradients