紫外液相色谱法测定可乐中咖啡因

( 上接第 2342 页 ) HBV 是嗜肝 DNA 病毒 , 其 S 基因 编码 合成 的 HBV 外膜 蛋白由 3 种蛋白组成 , 分别 是主 蛋白 ( 即 H BsA g) 、 中 蛋白 ( 即 HBsA g 、 P re- S2 ) 和 大 蛋 白 ( 即 HBsA g 、P re - S 1 和 P re S2) [ 5] 。近年来随着 对 HBV 外膜 蛋白 在乙 型肝 炎发 病机 制、 感染与病毒复制 等方 面研究 的深 入 , 研究 者们 逐渐 认识 到了 其具有越来越重要的 临床意义 [ 6~ 8] 。 FOON C[ 9] 证明 H BV - LP 是导致肝细胞损 伤、 死亡 和纤维 化病 变的 主要 原因 且具 有反 式激活病毒复制作用 , 因此检测 HBV - LP 可 以反映病 毒复情 况和预后情况。 通过对 376 例乙型肝 炎病人 的检测 , 我们 检出 HBV DNA 阳性率为 77 1% , H BV - LP 阳性率为 74 2 % , 经 2 检 验两者 差异无统计学意义 ( P > 0 05) 。二者在 定性检测方 面 , HBV LP的阳性 率稍低于 HBV DNA 不能与 HBV DNA 阳性 率完全 一致 , 这种差异是由于方法学不同 , 检 测的成 分和特异 性不同 造成的 , 可能原因 是 HBV DNA 检测 灵敏度 较高 或是 H BV 基 因前 S 区变异所 致的 H BV - LP 漏检。二 者在 定量 检测 的相 关性研究中 , 由表 3 可得 H BV - LP ( A ) 值与 HBV DNA 拷贝数 的对数有较 好的 相关 关系。 HBV - LP ( A ) 值 随着 HBV DNA 拷贝数的增加而增加 , H BV - LP 的阳性率也随之增加 , 两者有 良好的一致性。 HBV - LP 能较可靠地反 映 H BV 复制 情况 , 可 以作为 HBV 感染、 复制和乙肝患者诊断、 治疗和预后的重要参 考指标 , 具有较好的临床应用价值。 本实验研究 发现 不同 的乙 肝血 清学 标志 物模 式 中 , H BV DNA 和 HBV - LP 阳性 率有不 同的 表 现 , HB s A g 和 HBeAg 同 时阳 性 的 HBV DNA 和 HBV - L P 均 有 较 高 的 阳 性 率 , 而 HBeA g阴性 者 HBV DNA 和 HBV - LP 阳 性 率 都 较 低 , 在 HBeA g阴性的乙肝患者中血清 HBV - LP 和 HBV DNA 阳性率 具有一致性 , 说明利用针对 HBV - LP 前 S 蛋 白的构象 表位制 备的单抗检测血清 HBV - LP 与 P re - S1 蛋白和 H Be A g 相比 , 更能反映 HBV 的复制情况 , 是判断 HBV 复制的较好的血清学
[ 2 ] 刘平年
高效液相色谱法 测定巧克 力中的可 可碱和 咖啡因 [ J]
化学分析计量 , 2005 , 14( 2 ): 30 [ 3 ] 王晓燕 , 曾莉 , 肖郁惠 , 等 高效液相色谱法测定茶多酚中的咖啡 因 [ J] 现代预防医学 , 2005, 32( 8) : 989 [ 4 ] 徐学笛 高效液相色谱法测定 咖啡因含 量的研究 与探讨 [ J] 科 ( 收稿日期 : 2008- 05 - 26) 技成果纵横 , 2008 , 2 : 60
中国卫生检验杂志 2008年 11 月 第 18 卷 第 11期
Ch in ese Jou r n al of H ealth Laboratory Techno logy, N ov 2008; V ol 18 N o 11
2399
经验交流
紫外液相色谱法测定可乐中咖啡因
徐明敏 , 陈波, 杨毅华
( 浙江省宁波市北仑区疾病预防控制中心 , 浙江宁波 [ 关键词 ] 272 nm 波长 ; 紫外液相色谱 ; 可乐 ; 咖啡因 O 657 7+ 2 [ 文献标识码 ] C [ 文章编号 ] 1004- 8685( 2008) 11- 2399- 02 315800)
[ 1 ] B russ V En velop m en t of th e hepat it is B virus nucleocapsid[ J] V irus R es , 2004 , 106: 199- 209 [ 2 ] Lam bert C, M ann S, Prange R, et al A sessm ent of deter m inants effec t ing the dual topo logy of hep adnavrial large envelop e proteins [ J] J G en V iro, l 2004 , 85: 1221- 1225 [ 3] H ildt E, Saher G, Bruss V, et al TheH epat it is B V iru s Large Surface P rotein ( LH Bs) Is aT ran scrip tional A ctivator[ J] J V iro, l 1996, 225 : 235 - 239 [ 4 ] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、 肝病 学分会联合 修订 病 毒性肝炎防治方案 [ J] 中华传染病杂志 , 2001 , 19( 1 ): 56- 62 [ 5 ] B arrera A, G uerra B, N otval,l et a l M app ing of th e hepat it is B virus pre- S1 dom ain invo lved in recep tor recogn it ion [ J] J V iro,l 2005 , 79: 9786- 9798 [ 6 ] B russ V, V ielu f K Functions of the internal pre- S dom ain of the large surface protein in hepat it is B virus part iclem opphogenesis[ J] J V iro, l 1995, 69( 11 ) : 6652- 6657 [ 7 ] 吴正林 , 刘玢 , 肖桂初 , 等 乙型肝 炎病毒表面大 蛋白检测 的临床 应用研究 [ J] 中华医学感染学杂志 , 2007 , 17( 6 ) : 624- 626 [ 8 ] 孙颖 , 辛绍杰 , 雷厉 , 等 乙肝病毒外膜蛋白检测对判定 HBV DN A 复制的意义 [ J] 世界华人消化杂志 , 2006 , 14( 3 ) : 354- 357 [ 9 ] Foo NC, A hn BY, M a X C ellu lar vacuolizat ion and apop tos is induced by hepat it is B virus large su rface protein [ J] H epatology , 2002 , 36 ( 6 ): 1400- 1407 ( 收稿日期 : 2008- 09 - 15)
2 结果与讨 论 2 1 流动相的选择 选用合适的流动 相及 配比 浓度 , 能够 调节 流动 相的 极性 和洗脱能力 , 国标 GB /T5009 139- 2003 的高效 液相色 谱法选 用乙腈、 水、 甲醇作流动相 , 对只配 置二元泵 的液相 色谱仪 , 需 先混合 , 且乙腈毒性较大。本文选用 的流动 相及配 比浓度 , 能 使可 乐 中 的 干 扰 物 质 有 效 分 离 , 咖 啡 因 的 保 留 时 间 为 4 140 m in, 色谱分离见图 1 。
图 1 色谱分离图
2 2 测定波长的选择 根据仪器公司提供的 272 nm 为 咖啡因的测 定波长 , 用来 校正紫外检测器 的灵 敏度这 一特 性 , 实验中 分别选 用 272 nm 和 286 nm 的 波 长 对 104 4 m g /L 的 咖 啡 因 标 准 进 行 测 定 , 272 nm 波长的测定灵敏度较 286 nm 波长高。色谱对照见图 2。
标准系列 标准浓度 ( m g /L) 峰面积 相关系数 回归方程 检出限 ( m g /L)
1 17 4 266378 r = 0 9999
2 34 8 537225
3 52 2
对同 一 样 品 连 续 测 定 6 次 , 结 果 分 别 为 91 7、92 2、 92 1、92 2、91 8、91 6 mg /L, 平 均 值 为 91 9 m g /L, RSD 为 0 289% 。 3 小结 本方 法选用 272 nm 的紫外 检测波 长 , 甲醇、 水 为流 动相 测定可 乐中咖啡 因 含量 , 样品 前处 理 简单 , 干扰 物 质 分离 效 果好 , 测定 方法的线性 范围宽 , 样品 加标 回收 率、 相对 标准 偏 差均符 合分析检 测要求 , 尤其适 用于 只有二 元泵 的基 层实 验 室。 [ 参考文献 ]
表 2 样品加标回收试验 名称 样品 1 样品 2 本底值 ( m g /L) 96 1 96 1 48 5 48 5 加标量 ( m g /L) 34 8 15 7 34 8 15 7 测定值 ( mg /L ) 129 5 112 2 82 5 65 0 回收率 (% ) 96 0 102 5 97 7 105 1
图 2 咖啡因色谱图 1为 272 nm, 2为 286 nm 波长
2 3 咖啡因工作曲线及检出限 可乐中 咖啡 因的卫 生标 准为 限量标 准 , 即 < 45 mg /L, 故
[ 作者简介 ] 徐明敏 ( 1968 - ) , 女 , 主管技师 , 主 要从事理化检验 工作。
选择一条包含卫生 标准 的工作 曲线 ( 具 体浓 度以天 平称 量为 准 ), 此次测定的工作曲线为 17 4~ 156 6 m g /L 。在选 定的色 谱条件下 , 按仪器的 3 倍噪声计算检出限 , 详见表 1。

[ 中图分类号 ]
咖啡因 ( Ca ffe ine ) 化学名是 1, 3 , 7- 三甲基黄嘌呤或 3 , 7 - 二 氢 - 1, 3, 7 三甲 基 - 1H - 嘌呤 - 2, 6 - 二 酮。 分 子量 194 19, 是从茶叶、 咖啡果中提炼出来的一种生物碱 , 适度地使 用有祛除疲劳、 兴奋神经的作用 , 临床 上用于 治疗神经 衰弱和 昏迷复苏。但大剂 量或 长期 使用 也会 对人 体造 成损 害 , 特别 是它也有成瘾 性。目前 可乐、 红 牛等 饮料 中常 含有 一定 量的 咖啡因 , 其测定方法采用国 标 GB /T 5009 139- 2003 的 高效液 相色谱法。该法采用 286 nm 为测 定波长 , 甲醇、 乙腈、 水为流 动相 , 对只配置二元泵的液相 色谱仪 , 操作 比较麻 烦。实际工 作中 , 通过方法改 进 , 采用 水、 甲醇 为流 动相 , 操 作简 单 , 方法 的灵敏度、 检出限符合测定要求。 1 材料与方法 1 1 仪器与试 剂 日本岛津 LC- 10AT vp 高 效液 相色 谱仪 , 带 SPD - 10A vp 紫外检测器 ( 波长范围 200~ 600 nm ), 色谱 柱 shi m - pack cL c - ods柱 , 6 0 mm ID ! 15 c m, N 2000 数 据处理 软件 ; 超 声波脱 气装置 ; 纯水 , 经 0 45 m 滤 膜过 滤 , 脱气 15 m in; 甲醇 : 液相 色谱级 , 脱气 15 m in; 咖啡因固体 标准 , 由国标中心提供。 1 2 色谱分析 条件 流动 相 : A 泵 : 甲 醇 , B 泵 : 纯 水 , 配 比 : 50 : 50, 流 速 : 1 0 m l/m in, 柱温 : 40∀ 。 1 3 实验方法 1 3 1 标准溶液的配制 准确称取 0 1740 g 咖啡因 标准 , 用 甲 醇 溶 解 , 并 定 容 至 50 m , l 此 标准 储备 液的 浓度为 3 48 m g /m l 。再吸取此储 备液 5 00 m l 置于 50 m l 容 量瓶中 , 用甲醇稀释至刻度 , 此标准浓度为 348 g /m l 。 1 3 2 标准曲 线的 制备 分 别吸 取 348 g /m l 的 标准 溶液 0 25、 0 50、 0 75、 1 50、 2 25 m l置于 5 0 m l 容量瓶中 , 加甲醇 稀释至 刻 度 , 混 匀 , 此 标 准 系 列 的 浓 度 为 17 4、34 8、52 2、 104 4、 156 6 m g /L 。 1 3 3 样品处理 试样用超声脱气 20 m in 。 1 3 4 测定 取 样品 与标 准溶 液 各 10 l 进高 效 液相 色谱 仪 , 根据保留时间定性 , 以峰面积为 x对浓度 y 计算回归方程 , 外标法定量。