非特异性脂质转移蛋白突变体的构建及在两种硫氧还蛋白表达载体中的表达比较

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硫氧还蛋白_Trx_的研究进展

分子植物育种，２００６年，第４卷，第６（Ｓ）期，第７８－８２页ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．６（Ｓ），７８－８２专题介绍Ｒｅｖｉｅｗ硫氧还蛋白（Ｔｒｘ）的研究进展郑琼马旭俊杨传平＊教育部林木遗传育种与生物技术重点实验室，东北林业大学林木遗传育种省级重点实验室，东北林业大学林学院，哈尔滨，１５００４０＊通讯作者，ｙａｎｇｃｐ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ摘要硫氧还蛋白Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ）是一类高度保守的低分子量蛋白质。

Ｔｒｘ广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中。

根据氨基酸序列的不同，Ｔｒｘ分为家族Ⅰ和家族Ⅱ２个家族。

根据最初结构的不同，Ｔｒｘ家族Ⅰ又被分为６大类型：ｈ，ｆ，ｍ，ｏ，ｘ和ｙ。

不同类型的Ｔｒｘ在不同生物以及细胞内的不同区域分布不同。

硫氧还蛋白具有多种生物学功能，对维持体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。

Ｔｒｘ具有调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录等功能。

Ｔｒｘ还与植物抗逆性相关，如参与植物抗旱、耐热和抗氧化胁迫过程，调节抗逆基因的表达。

因此，我们可以将硫氧还蛋白基因通过转基因技术导入植物体中，在植物遗传性状改良等方面具有广泛的应用前景。

本文综述了硫氧还蛋白的类型、组织分布、生物学功能以及与植物抗逆性的关系。

关键词硫氧还蛋白（Ｔｒｘ），氧化还原，抗逆性ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＲｏｌｅｓｏｆＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ）ＺｈｅｎｇＱｉｏｎｇＭａＸｕｊｕｎＹａｎｇＣｈｕａｎｐｉｎｇ＊ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＢｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＴｈｅＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙＧｅ－ｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００４０＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｙａｎｇｃｐ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ）ｉｓａｓｍａｌｌａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｒｘｉｓｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙｆｏｕｎｄｉｎｐｌａｎｔｓ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｙｅａｓｔｓａｎｄａｎｉｍａｌｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＴｒｘｉｓｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆａｍｉｌｙⅠａｎｄｆａｍｉｌｙⅡ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＴｒｘｆａｍｉｌｙⅠｉｓｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏ６ｇｒｏｕｐｓ：ｈ，ｆ，ｍ，ｏ，ｘａｎｄｙ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｏｆＴｒｘｅｘｉｓｔｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｐａｒｔｍｅｎｔｓｏｆａｃｅｌｌ．Ｔｒｘｈａｓｖａｒｉｏｕｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｋｅｅｐｉｎｇｓｔａｂｌｅｒｅｄｏｘｓｔａｔｕｓｏｆｃｅｌｌｓ．Ｔｒｘｐｌａｙｓｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎ．Ｉｔｉｓａｌｓｏｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎ－ｃｌｕｄｅｄｒｏｕｇｈｔ，ｈｅａｔａｎｄｏｔｈｅｒｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｔｒｅｓｓｅｓ．ＳｏｗｅｅｘｐｅｃｔＴｒｘｇｅｎｅｃａｎｂｅｆｕｒｔｈｅｒｕｓｅｄｉｎｐｌａｎｔｔｒａｉｔｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｔｈｉｓｇｅｎｅｉｎｔｏｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｔｙｐｅ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃ－ｔｉｏｎｓｏｆＴｒｘａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ），Ｒｅｄｏｘ，Ｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ硫氧还蛋白（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，Ｔｒｘ）是一类分布广泛的低分子量的蛋白质，它们在进化上相当保守，有一个二硫化物活性中心Ｔｒｐ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（ＣＧＰＣ），ＣＧＰＣ中的２个Ｃｙｓ分别为Ｃｙｓ３２和Ｃｙｓ３５，人和其它哺乳动物Ｔｒｘ还含有另外３个Ｃｙｓ残基，即Ｃｙｓ６２、Ｃｙｓ６９和Ｃｙｓ７３，这些Ｃｙｓ残基能可逆地催化许多氧化还原反应，赋予Ｔｒｘ独特的生物学特性。

高表达UBE2S通过增加癌细胞干性促进肝癌的进程机制

高表达UBE UBE22S 通过增加癌细胞干性促进肝癌的进程机制陈浩1，2，3，李振汉4，王明婷5，卢林明3，唐乾利2，罗良平11暨南大学临床医学博士后流动站，广东广州510632；2右江民族医学院研究生学院，广西百色533000；皖南医学院3病理解剖学教研室，4临床医学院，安徽芜湖241002；5南京市第一医院产科，江苏南京210006High expression of UBE2S promotes progression of hepatocellular carcinoma by increasing cancer cell stemnessCHEN Hao 1,2,3,LI Zhenhan 4,WANG Mingting 5,LU Linming 3,TANG Qianli 2,LUO Liangping 11Postdoctoral Research Station of Clinical Medicine,Jinan University,Guangzhou 510632,China;2Graduate School,Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China;3Department of Pathology,4School of Clinical Medicine,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China;5Department of Obstetrics,Nanjing First Hospital,Nanjing 210006,China摘要：目的探究UBE2S 在肝癌微环境不同细胞类型的特异性表达及对肝癌细胞干性的影响。

方法使用TCGA 数据库分析肝癌中UBE2S 转录水平及其启动子甲基化水平差异，使用CPTAC 数据库分析UBE2S 蛋白水平差异。

水稻ＡＰＹ１_基因克隆及胁迫表达分析

酸酶ＧＤＡ１ / ＣＤ３９家族特征结构域ꎬ 特征序列为
检测水稻幼叶中ＯｓＡＰＹ１基因表达水平ꎬ 如图３所
大疏水值ꎬ 最大亲水值出现在第３２５位氨基酸附近ꎻ
水淹的情况下提升最为显著ꎬ 其次是干旱胁迫下ꎬ 分
(１００％) ꎻ 在氨基酸序列２０６ ~ ２２１位存在１个核苷磷
中分布于细胞壁 [１] 、高尔基体 [２] 、核膜 [３] 等不同的细
胞器上ꎬ 可将胁迫、创伤期间积累在细胞外膜中的
ｅＡＴＰ水解为二磷酸苷 (ＡＤＰ) 和一磷酸腺苷 (ＡＭＰ)ꎮ
研究表明ꎬ 植物ＡＰＹ基因调控植物抗氧化、生
长及抗逆反应
ꎮ 拟南芥的ＡＰＹ基因家族由７个成
图１ＯｓＡＰＹ１基因ＣＤＳ区ＰＣＲ检测
２２ＯｓＡＰＹ１蛋白生物信息学分析
ＯｓＡＰＹ１蛋白由４８９个氨基酸组成ꎬ 理论等电点
图２ＯｓＡＰＹ１蛋白进化树分析
为５７２ꎬ 丙氨酸含量最高 ( １１２％) 、亮氨酸次之
２４多种胁迫下ＯｓＡＰＹ１基因表达水平分析
２０μＬ反应体系ꎬ 按照ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ说明书ꎬ 重复３次
实验ꎬ ２
－ΔΔＣｔ
方法统计分析结果ꎮ
表１引物序列
基因
引物序列 (５’ —３’ )
用途
பைடு நூலகம்
ＯｓＡＰＹ１
Ｆ１: ＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＣＧＧＣＣꎻ Ｒ１: ＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴ
普通ＰＣＲ
ＯｓＡＰＹ１
ＯｓｅＥＦ－１
Ｆ: ＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＡＣＣＧＴＴꎻ Ｒ: ＣＴＴＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴ

高尔基体概述

高尔基体概述高尔基体（Golgi apparatus）是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。

又称高尔基器或高尔基复合体；在高等植物细胞中称分散高尔基体。

最早发现于1855年，1898年由意大利人卡米洛•高尔基（Camillo Golgi，1844-1926）在光学显微镜下研究银盐浸染的猫头鹰神经细胞内观察到了清晰的结构，因此定名为高尔基体。

因为这种细胞器的折射率与细胞质基质很相近，所以在活细胞中不易看到。

高尔基体从发现至今已有100多年的历史，其中一半以上的时间是进行关于高尔基体的形态甚至是它是否真实存在的争论。

细胞学家赋予它几十种不同的名称，也有很多人认为高尔基体是由于固定和染色而产生的人工假像。

直到20世纪50年代应用电子显微镜才清晰地看出它的亚显微结构。

它不仅存在于动植物细胞中，而且也存在于原生动物和真菌细胞内。

形态与组成高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。

常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出的一面对着内质网称为形成面（forming face）或顺面（cis face）。

凹进的一面对着质膜称为成熟面（mature face）或反面（trans face）。

顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡，在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。

顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡（图6-24），在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中（图6-25）。

图6-24高尔基体各部分的名称图6-25培养的上皮细胞中高尔基体的分布（高尔基体为红色，核为绿色）引自/因其看上极像滑面内质网，因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。

扁平囊的直径为1μm，由单层膜构成，膜厚6~7nm，中间形成囊腔，周缘多呈泡状，4~8个扁平囊在一起，某些藻类可达一二十个，构成高尔基体的主体，称为高尔基堆（Golgi stack）。

高尔基体膜含有大约60%的蛋白和40%的脂类，具有一些和ER共同的蛋白成分。

mTORC1

mTORC1/2双重抑制剂OSI -027抑制高氧诱导的肺成纤维细胞增殖和分化*吴黎虹，唐坤，党红星△，符跃强，刘成军，李静，许峰（重庆医科大学附属儿童医院重症医学科，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014）［摘要］目的：分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin ， mTOR ）复合物1/2（mTORcomplex 1/2， mTORC1/2）双重抑制剂OSI -027对高体积分数氧（高氧）所致人胚肺成纤维细胞增殖和分化的抑制作用。

方法：高氧（95% O 2）处理人胚肺成纤维细胞MRC -5建立增殖分化模型，分为对照组、高氧组、高氧+OSI -027组和高氧+雷帕霉素组。

Western blot 检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin ， α-SMA ）、I 型胶原蛋白（collagen type I ， Col I ）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ， PCNA ）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、RhoA 、Rho 相关含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho -associated coiled -coil -containing protein kinase 1， ROCK1）、蛋白激酶B （protein kinase B ， PKB/AKT ）、p -AKT 和mTOR 的表达； CCK -8实验检测细胞活力；流式细胞术检测细胞周期。

结果：与对照组相比，PCNA 、cyclin D1、Col I 和α-SMA 表达随高氧处理时间增加而增加（P <0.05）。

与高氧组相比，OSI -027及雷帕霉素干预后，细胞活力下降，细胞周期被抑制在G 1期（P <0.05）。

胞嘧啶脱氨基酶APOBEC1研究进展

胞嘧啶脱氨基酶APOBEC1研究进展作者：周冰涵严小璇蓝文贤王春喜曹春阳来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2020年第03期摘要：為全面理解载脂蛋白B mRNA（ApoB mRNA）编辑酶催化多肽-1（APOBEC1）的作用机制，介绍了APOBEC1和ApoB mRNA的蛋白及核酸序列，总结并绘制了APOBEC1与不同的辅助蛋白的结合模型，阐述了APOBEC1催化ApoB mRNA第6 666位的胞嘧啶（C6666）脱氨基化分子机制.列举了啮齿动物APOBEC1抑制多种逆转录病毒的研究报道，介绍了兔源APOBEC1结合人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）的病毒粒子并编辑病毒基因组的机理.同时介绍了APOBEC1通过编辑胞嘧啶或与AU富集元件（ARE）结合来调控癌症等疾病相关的细胞因子表达.关键词：载脂蛋白B mRNA（ApoB mRNA）; 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽-1（APOBEC1）; 胞嘧啶脱氨基化中图分类号： Q-71 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2020）02-0234-11Research advances on cytosine deaminase APOBEC1ZHOU Binghan1，2， YAN Xiaoxuan2， LAN Wenxian2， WANG Chunxi2， CAO Chunyang2*（1.College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China; 2.State Key Lab of Bio-organic and Natural Products Chemistry，Shanghai Institute of Organic Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200032，China）Abstract： In order to fully understand the mechanisms of Apolipoprotein B mRNA（ApoB mRNA） editing enzyme catalytic polypeptide-1（APOBEC1），this review introduced the amino acid and nucleic acid sequences of APOBEC1 and ApoB mRNA，summarized and mapped the binding models of APOBEC1 with different cofactors to explain the molecular mechanism of APOBEC1 catalyzing the deamination of the 6666 C of ApoB mRNA （C6666）.The researches of rodent APOBEC1 inhibiting multiple retroviruses were exemplified here，and the related mechanisms of rabbit APOBEC1 binding to human immunodeficiency virus type 1（HIV-1）and editing the viral genome were discussed.This review also introduced APOBEC1 regulating the expression of cytokines related to cancers and other diseases by deamination editing or combining with AU-rich element（ARE） of RNAs.Key words： apolipoprotein B mRNA（ApoB mRNA）; ApoB mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-1（APOBEC1）; cytidine deamination0 引言载脂蛋白B mRNA（ApoB mRNA）编辑酶催化多肽（APOBEC家族）是一类胞嘧啶脱氨基酶，能催化单链RNA或单链DNA中的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶.APOBEC家族由活化诱导胞嘧啶脱氨基酶（AID），ApoB mRNA编辑酶催化多肽-1（APOBEC1），APOBEC2，APOBEC3亚家族（APOBEC3A，APOBEC3B，APOBEC3C，APOBEC3D，APOBEC3E，APOBEC3F，APOBEC3G，APOBEC3H），以及APOBEC4组成.其中APOBEC1与AID串联排列于第12号染色体，APOBEC2位于第6号染色体，APOBEC3亚家族以串联重复的方式排列于第22号染色体[1]，APOBEC4则位于第1号染色体[2]，如图1（a）所示.APOBEC家族成员脱氨基催化活性由1个或2个锌指结构域提供，位于锌指结构域的氨基酸序列在APOBEC家族中相当保守：His-X-Glu-X23–28-Pro-Cys-X2-4-Cys（其中X表示任何氨基酸）;AID，APOBEC1，APOBEC3A，APOBEC3C，APOBEC3H为单锌指催化结构域;APOBEC3B，APOBEC3D，APOBEC3F，APOBEC3G则含有2个锌指催化结构域，如图1（b）所示，而APOBEC2与APOBEC4暂无结构相关报道[2].APOBEC家族中研究最深入的是AID与APOBEC3亚家族，两者都有以DNA为底物的高效脱氨基催化活性，最广为人知的功能是在外源性病毒逆转录过程中对DNA进行编辑，使病毒DNA发生降解以抑制病毒逆转录过程，如人源APOBEC3G编辑人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）DNA以抑制HIV-1在人体中的复制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2）随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白[3-4].近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脫氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1与辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.1 APOBEC1研究进展1.1 APOBEC1功能域及结构研究APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性[5]，构成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X23-28-C-P-X2--C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被4认为是核定位信号的一部分[6-7]，它们对编辑反应很重要[8].MEHTA等[9]发现，APOBEC1的N 端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA[8，11]，IKEDA等[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA的胞嘧啶进行脱氨基催化[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论[13].IKEDA等[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C6666脱氨基化转变为尿嘧啶（U6666），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C6666AA（Q2153）突变为终止密码子U6666AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未经编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512 000）[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X23-28-Cys-Pro-X2-4-Cys[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化[12，17].HARRIS等[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn2+）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn2+作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH-的进攻;OH-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH2）接受了被Glu螯合的质子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH3），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，編辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2）随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白[3-4].近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脱氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1与辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.1 APOBEC1研究进展1.1 APOBEC1功能域及结构研究APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性[5]，构成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X23-28-C-P-X2--C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被4认为是核定位信号的一部分[6-7]，它们对编辑反应很重要[8].MEHTA等[9]发现，APOBEC1的N 端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA[8，11]，IKEDA等[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA 的胞嘧啶进行脱氨基催化[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论[13].IKEDA等[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C6666脱氨基化转变为尿嘧啶（U6666），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C6666AA（Q2153）突变为终止密码子U6666AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未经编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512 000）[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X23-28-Cys-Pro-X2-4-Cys[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化[12，17].HARRIS等[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn2+）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn2+作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH-的进攻;OH-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH2）接受了被Glu螯合的质子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH3），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2）随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白[3-4].近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脱氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1与辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.1 APOBEC1研究进展1.1 APOBEC1功能域及结构研究APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性[5]，構成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X23-28-C-P-X2--C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被4认为是核定位信号的一部分[6-7]，它们对编辑反应很重要[8].MEHTA等[9]发现，APOBEC1的N 端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA[8，11]，IKEDA等[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA 的胞嘧啶进行脱氨基催化[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论[13].IKEDA等[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C6666脱氨基化转变为尿嘧啶（U6666），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C6666AA（Q2153）突变为终止密码子U6666AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未经编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512 000）[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X23-28-Cys-Pro-X2-4-Cys[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化[12，17].HARRIS等[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn2+）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn2+作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH-的进攻;OH-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH2）接受了被Glu螯合的质子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH3），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2）随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白[3-4].近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脱氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1与辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.1 APOBEC1研究进展1.1 APOBEC1功能域及结构研究APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性[5]，构成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X23-28-C-P-X2--C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被4认为是核定位信号的一部分[6-7]，它们对编辑反应很重要[8].MEHTA等[9]发现，APOBEC1的N端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA[8，11]，IKEDA等[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA 的胞嘧啶进行脱氨基催化[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论[13].IKEDA等[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C6666脱氨基化转变为尿嘧啶（U6666），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C6666AA（Q2153）突变为终止密码子U6666AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未經编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512000）[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X23-28-Cys-Pro-X2-4-Cys[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化[12，17].HARRIS等[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn2+）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn2+作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH-的进攻;OH-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH2）接受了被Glu螯合的质子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH3），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2）随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白[3-4].近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脱氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1与辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.1 APOBEC1研究进展1.1 APOBEC1功能域及结构研究APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性[5]，构成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X23-28-C-P-X2--C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被4认为是核定位信号的一部分[6-7]，它们对编辑反应很重要[8].MEHTA等[9]发现，APOBEC1的N 端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA[8，11]，IKEDA等[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA 的胞嘧啶进行脱氨基催化[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论[13].IKEDA等[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C6666脱氨基化转变为尿嘧啶（U6666），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C6666AA（Q2153）突变为终止密码子U6666AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未经编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512 000）[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X23-28-Cys-Pro-X2-4-Cys[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化[12，17].HARRIS等[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn2+）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn2+作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH-的進攻;OH-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH2）接受了被Glu螯合的质子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH3），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2）随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白[3-4].近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脱氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1與辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.1 APOBEC1研究进展1.1 APOBEC1功能域及结构研究APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性[5]，构成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X23-28-C-P-X2--C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被4认为是核定位信号的一部分[6-7]，它们对编辑反应很重要[8].MEHTA等[9]发现，APOBEC1的N端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA[8，11]，IKEDA等[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA 的胞嘧啶进行脱氨基催化[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论[13].IKEDA等[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C6666脱氨基化转变为尿嘧啶（U6666），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C6666AA（Q2153）突变为终止密码子U6666AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未经编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512000）[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X23-28-Cys-Pro-X2-4-Cys[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化[12，17].HARRIS等[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn2+）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn2+作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH-的进攻;OH-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH2）接受了被Glu螯合的质子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH3），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1）与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动。

硫氧还蛋白的结构及在生物抗氧化中的功能

文章编号 : 1000-1336(2011)03-0429-05硫氧还蛋白的结构及在生物抗氧化中的功能马宇光杨帆杨卫军浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所，杭州 310058摘要：硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是广泛存在于原核与真核生物体内的氧化还原调节蛋白。

Trx 通过对目标蛋白质进行还原，从而调节机体的氧化还原平衡。

Trx 与硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)及NADPH 共同组成硫氧还蛋白系统参与众多生理过程。

细胞中的活性氧是导致生物氧化胁迫的一个主要方面。

Trx 可以通过对细胞内被氧化的二硫键的还原来修复机体的氧化损伤，并通过这种方式防止机体衰老。

同时，Trx 系统可以与其它氧化还原系统如谷胱甘肽(GSH)系统协调配合，并消除体内过多的活性氧。

关键词：硫氧还蛋白；氧化胁迫；活性氧中图分类号：Q71硫氧还蛋白(thioredoxin , Trx)是一类广泛存在于原核和真核生物体内的小分子蛋白质，具有维持生物体内氧化还原平衡和调控生物信号传导等多种功能。

Tr x 与硫氧还蛋白还原酶(thioredo xin reductase, T rx R )[1]和NADPH 构成了T rx 硫氧还蛋白系统[2]，该系统具有修复被氧化蛋白质、消除生物体内氧自由基的抗氧化作用并对肿瘤的生长起着促进作用。

1. 硫氧还蛋白的结构特点与硫氧还蛋白系统迄今，已有多个物种的Trx 结构得到了解析，对比发现，在不同物种中发现的T r x 在进化上高度保守，分子量都在12 kDa 左右，大都具有-Cys-Gly-Pro- Cys-(-CGPC-)的活性中心位点。

活性位点中两个半胱氨酸巯基能够可逆地形成二硫键，使Trx 具有氧化态和还原态两种存在形式，参与氧化还原反应。

Trx 具有极其牢固的三级结构(图 1)，其分子内四图 1 Escherichia coli 的T rx 三级结构[4]图中的两个实心圆代表活性中心位点中形成二硫键的两个硫原子。

重组大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)的制备及功能分析

智库时代·121·社会治理重组大肠杆菌硫氧还蛋白（Trx）的制备及功能分析孙风梅（大同市现代教育培训中心，山西大同 037006）摘要：Trx 是一类广泛存在于各类生物中的小分子酸性蛋白质，含有二硫化物活性中心Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)，可降低食物中由二硫键引起的变应原反应，因而Trx 在食品工程和抗过敏药物中具有应用前景。

本论文从大肠杆菌Escherichi coli 基因组中扩增Trx 基因，构建大肠杆菌重组表达载体Trx-pET-28a(+)，转化入大肠杆菌BL21表达宿主进行 IPTG 诱导表达并对牛奶中β-乳球蛋白和酪蛋白的二硫键还原活性进行分析。

结果表明，重组Trx 具有二硫键还原酶的活性，能有效打开牛奶中β-乳球蛋白和酪蛋白的二硫键，有望开发成一种硫氧还蛋白脱敏制剂应用于食品安全领域。

关键词：硫氧还蛋白(Trx)；基因克隆表达与纯化；二硫键还原功能分析中图分类号：K826.15文献标识码：A文章编号：2096-4609（2018）01-0121-002硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是普遍存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质，分子量约12 kDa，其活性中心氨基酸序列(-Cys-Gly-Pro-Cys-)非常保守。

凭借其活性中心的两个半胱氨酸(Cys)残基，还原型Trx[Trx-(SH)2]能还原靶蛋白质的二硫键(protein-S2)。

广泛表达的硫氧还蛋白作为蛋白质二硫键的还原酶,参与很多生理过程,发挥重要生物学功能,包括调节抗氧化作用、抗胁迫作用、细胞凋亡过程、调节转录因子DNA 结合活性以及免疫应答等。

Trx 还和很多疾病相关,如阿尔茨海默氏症、癌症等。

近年来由于食品过敏性疾病发病率迅速攀升，许多过敏蛋白结构中都有大量的二硫键，因此可以寻求一种安全有效的硫氧还原剂破坏蛋白质分子内部的二硫键，降低食品过敏性已迫在眉睫。

为此笔者通过制备大肠杆菌重组Trx,对重组蛋白进行二硫键还原酶活性分析如下。

大肠杆菌表达系统的研究

大肠杆菌表达系统的研究大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。

大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到二十年前，Struhl等（1976）、Vapnek等（1977）和Chang等（1978）分别将酿酒酵母DNA片段、粗糙链孢霉DNA片段和哺乳动物cDNA片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达。

这些研究工作为大肠杆菌表达系统的发展奠定了理论基础。

Guarante等（1980）在Science杂志上发表了以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发展构成了大肠杆菌系统的雏型。

随着80年代后期分子生物学技术的不断发展，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善。

与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。

在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

1 表达载体大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。

又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。

理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。

（2）具有显性的转化筛选标记。

（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。

（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。

（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。

复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。

中图分类号：S852723

中图分类号:S 852.723　文献标识码:A 文章编号:167324696(2008)0120020205柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体TNF 2α基因表达动态的关系王彩霞,徐　赓,王黎霞,安　健3(北京农学院动物科学技术系,北京　102206) 摘要:根据GenBank 上鸡β2actin 、TN F 2α的基因序列设计引物,应用逆转录2聚合酶链式反应(R T 2PCR )技术克隆获得了β2actin 和TN F 2α基因,采用β2actin 为内参的半定量方法检测TN F 2αmRNA 在鸡柔嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况,以探讨TN F 2α基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系。

结果显示,TN F 2α基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式,首免后第9d 达到一个高峰,二免后第7d 达到另一个高峰。

结果表明,TN F 2α在抗球虫感染中有一定的作用。

关键词:β2actin 基因;柔嫩艾美球虫;盲肠扁桃体;R T 2PCR ;TN F 2α基因R elationship bet w een Eimeria tenella immunity and kineticexpression of TNF 2αgene in chicken cecal tonsil WAN G Cai 2xia ,XU Geng ,WAN G Li 2xia ,AN Jian(De partment of A ni mal S cience and Technolog y ,B ei j ing College of A g riculture ,B ei j ing 102206,China ) Abstract :According to chicken β2actin and TN F 2αgene sequences in GenBank ,primers were de 2signed ,and t he gene sequences were amplified by reverse t ranscriptase 2polymerase chain reaction (R T 2PCR )f rom t he cecal tonsil of chicken experimentally immunized wit h Ei meri a tenell a .The exp ression le 2vel of TN F 2αmRNA at different time after immunization was detected by semi 2quantitative R T 2PCR wit h β2actin gene as internal reference to st udy t he relationship between E.tenell a immunizatio n and t he kineticexpression of TN F 2αgene in chicken cecal tonsil.The result s showed t hat t he level of expression of TN F 2αgene reached 1st peak on day 9po st 21st 2immunization ,and reached 2nd peak on day 7post 2booster 2immunization.It was concluded t hat TN F 2αhad some effect against E.tenell a infection.K ey w ords :β2actin gene ;Ei meri a tenell a ;cecal tonsil ;R T 2PCR ;t umor necrosis factor 2αgene 鸡球虫病是由艾美属球虫寄生于鸡小肠和盲肠上皮细胞引起的一类原虫病,对养鸡业的危害相当严重。

基因工程复习资料

基因⼯程复习资料⼀、绪论1、简述基因⼯程的概念。

答：基因⼯程是指按照⼈们的设计，⽤⽣物技术直接操作⽣物的基因组。

通过分离和拷贝⽬的基因或⼈⼯合成外源基因，在体外将外源基因插⼊到载体分⼦中，成为重组DNA，再导⼊宿主细胞内，进⾏扩增和表达。

此过程所涉及的⽅法学称为重组DNA技术，也称分⼦克隆或基因操作。

2、列举基因⼯程中常⽤的⼀些技术。

答：（1）基因敲⼊：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利⽤靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。

（2）基因敲除：将⼀个特地设计的DNA⽚段导⼊⽣物体中，通过同源重组使靶基因被置换出⽽失活的实验技术。

（3）基因敲落：是⽤反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。

（4）基因打靶：是⽤同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。

（5）基因组编辑：⽤基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活⼦样效应物（TALE）和成簇间隔短回⽂重复（CRISPR）进⾏剪切。

⼆、基因⼯程的分⼦遗传学基础（⼀）名词解释1、基因表达：指DNA分⼦经转录产⽣互补的RNA分⼦。

2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的⼦代DNA分⼦的核苷酸序列均与亲代DNA分⼦相同，但⼦代DNA分⼦的双链⼀条来⾃亲代，另⼀条为新合成的链，故称为半保留复制。

3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。

半不连续模型是DNA复制的基本过程。

4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从⽽使核酸的天然构象和性质发⽣改变。

变性DNA常发⽣⼀些理化及⽣物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发⽣改变、增⾊效应。

5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的⼀种逆转过程。

热变性DNA⼀般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退⽕”。

蛋白质表达与肿瘤转移的关系

蛋白质表达与肿瘤转移的关系蛋白质是生物体内至关重要的分子，它们在细胞内发挥着各种功能，参与调控细胞的生长、分化、信号传递等生理过程。

肿瘤转移是一种癌症进展的重要表现，它导致肿瘤细胞从原发肿瘤转移到其他组织或器官，进一步加重了患者的病情。

在过去的几十年中，越来越多的研究表明，蛋白质表达异常与肿瘤转移密切相关。

本文将就蛋白质表达与肿瘤转移的关系展开论述。

一、蛋白质表达与肿瘤转移的基本机制1.1 蛋白质异常表达促进肿瘤转移蛋白质异常表达是肿瘤转移的重要机制之一。

肿瘤细胞表达的许多蛋白质，在正常细胞中并不表达或表达量较低，这些蛋白质的异常表达往往与肿瘤的增殖、侵袭和转移能力增强密切相关。

例如，研究发现转录因子Snail在肿瘤细胞中过度表达，能够抑制细胞黏附分子的表达，增加细胞的迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤转移的发生。

1.2 蛋白质异常修饰影响肿瘤转移蛋白质的异常修饰也是导致肿瘤转移的重要因素之一。

常见的蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化等。

这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，进而影响细胞的信号传导和转录调控，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强。

以磷酸化为例，磷酸化酪氨酸蛋白酶Src在肿瘤细胞中过度活化，能够促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，并在肿瘤转移过程中发挥重要作用。

二、蛋白质与肿瘤转移相关的分子机制2.1 上皮-间质转化 (EMT) 的蛋白质调控上皮-间质转化是肿瘤细胞从上皮样转化为间质样的过程，其中许多蛋白质发挥着重要调控作用。

EMT过程中，上皮细胞的细胞粘附分子表达下调，细胞形态发生改变，细胞间质的成分和结构发生相应变化，使得肿瘤细胞获得了更强的迁移和侵袭能力。

多个蛋白质如Snail、Slug、Twist等在EMT过程中被过度表达，通过抑制上皮细胞粘附分子的表达，改变细胞骨架结构等机制促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。

2.2 细胞外基质 (ECM) 的蛋白质调控细胞外基质是细胞外的一种复杂结构，由多种蛋白质如纤维蛋白、胶原蛋白等构成。

生物技术制药重点及名词解释

生物技术制药第一章绪论★生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类✦按用途分类：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)✦按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰（RNAi）药物、基因治疗药物✦按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG）化多肽或蛋白质药物★生物技术药物的特性✦理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差✦药理学作用特性:活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性✦生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染✦质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定（原液、半成品及成品检定等等)第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性（一般不进行常规的遗传毒性实验）；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法:构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰（降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节♦上游阶段:制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞♦下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装基本工具：目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞➢酶切结果：5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端➢1U核酸内切酶的酶活性:指在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量➢影响限制性内切酶反应的因素：♦DNA样品的纯度：♦DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。

Pronase E酶解释放糖蛋白N-糖链的方法及荧光标记衍生物的LC-MS分析

Pronase E酶解释放糖蛋白N-糖链的方法及荧光标记衍生物的LC-MS分析徐莎;张萍;黄琳娟;王仲孚【摘要】建立了一种用非特异性酶链酶蛋白酶 E(Pronase E)从糖蛋白上释放N-糖链的方法. 以牛胰核糖核酸酶 B(Ribo B)和鸡白蛋白(Chicken Albumin)为材料,用Pronase E代替N-糖苷酶 F(PNGase F)释放N-糖链. 当蛋白酶质量与糖蛋白质量比为1∶1时,得到只带一个天冬氨酸(Asn)的闭环N-糖链,称其为糖氨酸(glycan-Asn),这样既为糖链引入了天然的-NH2活性基团,同时还保持了糖链原有的还原端闭环结构. 以9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)为衍生试剂对解离后的糖氨酸进行衍生,采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-ESI/MS)对Fmoc-Cl糖氨酸衍生物进行分析,建立了糖蛋白的Pronase E酶解、微量糖氨酸的Fmoc-Cl衍生以及糖氨酸衍生物的HPLC-ESI/MS分析方法,该方法保持了N-糖链的天然结构,便于以-NH2为功能基团进一步进行荧光标记、分离制备以及糖链与蛋白质的相互作用研究.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2010(031)010【总页数】7页(P1992-1998)【关键词】Pronase E;糖蛋白;9-氯甲酸芴甲酯;电喷雾质谱;荧光标记【作者】徐莎;张萍;黄琳娟;王仲孚【作者单位】西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,西安,710069;西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,西安,710069;咸阳师范学院化学与化工学院,咸阳,712000;西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,西安,710069;西北大学生命科学学院,西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室,西安,710069【正文语种】中文【中图分类】O629.7糖基化（Glycosylation）是蛋白质翻译后修饰过程之一［1］，与DNA和蛋白质相比，糖蛋白糖链的结构更加多样，功能更加复杂，并且由于生物合成的非模板性和结构的微不均一性，使糖链具有了更多的分支结构、连接方式和空间构象，因此修饰后的糖蛋白会产生多种生物活性，对生物体的生长、发育甚至对生物体的生存起着至关重要的作用.一些重大疾病的发生也与糖基化异常相关［2，3］.蛋白质的糖基化与体液免疫和细胞免疫息息相关［4］，其中的糖链参与了B细胞的活化、抗原的处理与递呈等过程，并且可影响免疫球蛋白的结构与功能，调节T细胞活化与凋亡.但目前阶段还不能在完整糖蛋白的水平上对糖链的详细结构信息进行研究，而需先从多肽骨架上释放寡糖链，再进一步研究糖链结构与功能的关系.目前，N-糖链主要是用N-糖苷酶F（PNGase F）［5］酶解，再结合后续的毛细管电泳（CE）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）等技术对其进行分析.经PNGase F酶解能够得到完整的N-糖链和肽段，但由于糖链本身没有发色基团，不能直接用高灵敏度的检测方法如CE，HPLC及LC-MS等进行分析，因此需要通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团.衍生化后糖链的疏水性增加，易于在色谱柱上保留，还可提高质谱的灵敏度.在众多衍生化方法中［6］，还原胺化法由于产物稳定而成为常用的衍生化方法之一.该方法一方面可对糖链的还原端直接进行标记，而原糖链的回收比较困难，并且衍生后的糖链会形成还原端开环结构［7］，导致糖链的部分生物信息丢失以及对糖链的一些活性造成影响［8］;另一方面利用该反应还可使糖链还原端与铵盐等反应生成中间产物糖铵（Glycosylamine），Glycosylamine再与衍生化试剂如Fmoc-Cl和FITC［9］等反应，生成带荧光标记的衍生化产物，但此方法衍生过程复杂，糖链损失较大.鉴于上述存在的问题，Song等［7］利用非特异性蛋白酶链酶蛋白酶E（Pronase E）对多肽进行酶解，得到肽段长短不一的糖肽，再对其氨基直接衍生，进而将其应用到糖芯片的研究中.另外，An等［10］利用Pronase E酶解得到带有多个氨基酸的糖肽，通过与PNGase F酶解释放的糖链比较，对N-糖链的糖基化位点进行了研究.但这些方法均得到肽段长短不一的糖肽，影响了对糖链的进一步分析. 本实验在前期研究的基础上，以牛胰核糖核酸酶 B（Ribo B）和鸡白蛋白（Chicken albumin）为研究对象，通过加大Pronase E与糖蛋白的质量比，得到只带一个天冬氨酸残基的糖氨酸（glycan-Asn）［11］.该方法操作简单，保留了糖链原有的还原端闭环结构，并且避免了酶用量不足情况下，因糖肽肽段不均一所造成的复杂问题.实验用Fmoc-Cl［12］对酶解条件下产生的糖氨酸进行标记，省略了糖链进一步分析前必须先衍生成糖胺的步骤，并且后续工作可对糖链进行回收，衍生后的糖链可实现HPLC-MS在线联用分析.该方法在保持N-糖链天然结构的同时，以—NH2为功能基团进一步荧光标记，对研究糖与蛋白的相互作用具有重要意义.1.1 试剂与仪器N-糖苷酶 F（PNGase F）、鸡白蛋白（Chicken albumin）、9-Fluorenylmethyl chloroformate（Fmoc-Cl）、微晶纤维素填料（Microcrystalline powder）和阳离子交换柱填料（Dowex 50WX8-400 Ion-exchange resin）均为Sigma公司产品;石墨碳柱（Alletech carbograph，150 mg/4 mL，Grace Davison Discovery Science公司）;牛胰核糖核酸酶B（Ribo B）为Worthington公司产品;甲醇和乙腈为Fisher公司产品;链酶蛋白酶E（Pronase E）购自北京拜尔迪生物技术有限公司;乙基苯基聚乙二醇购自西安舟鼎国生物技术有限公司;糖蛋白变性液（将0.5 g十二烷基磺酸钠和0.62 g二硫苏糖醇均溶于10 mL水中，稀释10倍后使用）;PNGase F酶缓冲液（将1.9 g磷酸钠溶于10 mL水中，用磷酸调pH至7.5后使用）;其它试剂均为国产分析纯.反相C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，大连依利特公司）;Milli-Q超纯水系统（Milford公司）;Thermo LTQ-XL电喷雾电离串联质谱（美国Thermo Scientific公司）;QL-901型涡旋振荡器（其林贝尔公司）;Centrifuge 5418型离心机（Eppendorf公司）;BF-2000型氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）;RE 52-AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）.1.2 实验方法1.2.1 实验条件色谱条件:流动相A为乙腈，流动相B为0.01 mol/L乙酸铵缓冲溶液（pH=4.1）;梯度洗脱程序:0～90 min，80%B（体积分数，下同）～65%B;流速0.2 mL/min;进样量10 μL;紫外检测波长265 nm;柱温25℃.质谱条件:正离子模式;电喷雾离子源（ESI），喷雾电压4.5 kV;离子传输毛细管温度350℃;鞘气（Sheath gas）流速为30 arb，辅助气（Aux gas）流速为5 arb，反吹气（Ion sweep gas）流速为0 arb;扫描范围:m/z 1000～2000及m/z 2000～4000. 1.2.2 糖蛋白的酶解与衍生（1）PNGase F酶解:将5 mg糖蛋白溶于300 μL糖蛋白变性液中，于100℃变性10 min.冷却至室温后，加入PNGase F酶缓冲液和10%乙基苯基聚乙二醇各30 μL，再加入 PNGase F酶1 μL（500 unit），混匀后于37℃消化24 h，用氮气吹干仪浓缩，备用.（2）Pronase E酶解:将5 mg Pronase E酶溶于1 mL含0.1 mol/L Tris-盐酸和1 mmol/L CaCl2的缓冲液（pH=8.0）中，于60℃水浴中预热30 min.然后在上述含有Pronase E酶的缓冲液中加入5 mg糖蛋白，于37℃消化24 h后，于100℃变性5 min使酶失活，用氮气吹干仪浓缩，备用［13］.（3）糖链的纯化:糖链的纯化分两个步骤，第一步为用微晶纤维素柱除去大量的蛋白质:首先用约50倍柱体积的超纯水洗脱除去柱填料本身所含的一些寡糖如微晶纤维素，然后用2倍柱体积的正丁醇/甲醇/水（体积比4∶1∶1）洗脱液平衡柱子，上样后，再用25倍柱体积的正丁醇/甲醇/水（体积比4∶1∶1）除去蛋白质，最后用2倍柱体积的水缓慢洗脱收集目标样品;第二步为用石墨碳柱除去单糖、盐和缓冲液等，具体操作见参考文献［14］方法，样品干燥后进行ESI-MS分析. （4）糖氨酸的衍生:将糖链纯化后得到的糖氨酸溶于冷水中，使其最终浓度为10 mg/mL.糖氨酸的Fmoc-Cl衍生化见参考文献［12］方法，将衍生后的样品于70℃真空抽干，再加入约1 mL水，经阳离子交换柱除盐后用于ESI-MS分析.2.1 Pronase E 酶解链酶蛋白酶E（Pronase E）是一种非特异性蛋白酶，可随机作用于多肽上的不同位点，非特异性地将糖蛋白上结合的肽段酶切成短肽或者氨基酸，从而得到带短肽或氨基酸的糖肽，并可进一步用于糖链的荧光衍生或定量分析;而N-糖苷酶F （PNGase F）专一性地酶切N-糖链和蛋白之间的键，得到纯粹的还原性糖链，后续的衍生过程会破坏糖链的闭环结构.本实验通过加大Pronase E与糖蛋白的质量比，一次性酶解糖蛋白，释放只带一个天冬氨酸残基的糖链（糖氨酸）.两种酶解作用方式如图 1 所示［10］.2.1.1 Pronase E酶解条件的优化在酶解条件下，尽管蛋白酶对多肽进行非特异性地酶切，但基于这种酶自身的特性，还是不可避免地产生了肽段长短不均一的糖肽，因此需要优化酶解条件，得到均一的糖氨酸.本实验中主要通过调整酶与糖蛋白的质量比，最终酶解得到只带一个天冬氨酸的糖氨酸.实验以Ribo B为标准品优化了酶解条件，用Chicken albumin进一步对实验方法进行了验证.Ribo B是一种研究较成熟的含有N-糖链的糖蛋白，是由124个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其结合的糖链均为高甘露糖型寡糖链［15，16］.通过比较PNGase F和PronaseE释放的糖链和糖氨酸的分子量差异，研究不同用酶量对肽段酶解结果的影响.图2（A）为Ribo B经PNGase F酶解后得到的糖链质谱图，各主峰分子离子峰分别为m/z 1257.25，1419.25，1581.25，1743.33和1905.33，主要为［M+Na］+峰，主峰之间相差162 Da，与甘露糖残基的分子量一致，分别归属为 Man5-GlcNAc2，Man6-GlcNAc2，Man7-GlcNAc2，Man8-GlcNAc2和Man9-Glc-NAc2，糖链可能的结构如图中所示.图2（B）～（D）分别为Ribo B经不同用量Pronase E酶解后产生肽段长短不同的糖肽的MS图.在图2（B）中，当 Pronase E与 Ribo B质量比为1∶10时，产生 m/z为 1505.50，1667.42，1829.58和1991.50峰，各主峰分子离子峰相差162，与甘露糖残基的分子量基本一致.为进一步分析肽段，将PNGase F酶解和Pronase E酶解后得到的糖肽进行MS分析.结果发现，Pronase E与PNGaseF酶解后的糖肽质谱图中各主峰分子离子峰相差270，与Ribo B氨基酸序列中精氨酸（Arg）和天冬氨酸（Asn）的肽段分子量一致，推测其可能的结构为 Man5-GlcNAc2-Asn-Arg，Man6-GlcNAc2-Asn-Arg，Man7-Glc-NAc2-Asn-Arg和Man8-GlcNAc2-Asn-Arg，为一系列寡糖肽的［M+H］+峰，说明在此酶解条件下得到了带两个氨基酸的糖肽.在图2（C）中，当蛋白酶与糖蛋白质量比为1∶2时，酶解产生既有带2个氨基酸的糖肽，也有带1个氨基酸的糖肽，说明用酶量不足导致糖肽的酶解不完全.在图2（D）中，当酶与糖蛋白质量比为1∶1时，Ribo B经蛋白酶酶解后产生 m/z 为1386.91，1549.00，1710.91，1873.00和2035.00的［M+K］+峰，其分子量之间仍然相差162，可分别归属为Man5-GlcNAc2-Asn，Man6-GlcNAc2-Asn，Man7-GlcNAc2-Asn，Man8-GlcNAc2-Asn和Man9-GlcNAc2-Asn.通过比较图2（A）和（D）中各主峰的分子离子峰发现，相对应的峰之间相差114，与糖链及其带一个氨基酸后的分子量差异一致，说明在这种情况下酶解完全，而且产物均为糖氨酸型糖链.因此，选择Ribo B糖氨酸的Pronase E酶解条件为蛋白酶与糖蛋白的质量比1∶1.2.1.2 Pronase E酶解Chicken Albumin 通过对Ribo B进行研究，获得了最合适的用酶量，为了说明此酶解条件能够应用于更复杂的糖蛋白寡糖链的研究，采用该方法对Chicken Albumin中寡糖链进行分析，结果如图3所示.（A）PNGase F digestion;（B）Pronase E digestion.The purified glycopeptides were dissolved in 100 μL water before injection.图3（A）和（B）分别为PNGase F和Pronase E对Chicken Albumin酶解后的质谱图，对各主峰的分子离子峰进行归属发现，相对应的主峰之间相差114，与糖链及其带一个氨基酸后的分子量差异一致，与图2中分析结果相符，说明在选定的用酶量下Chicken Albumin经Pronase E酶解也得到了带一个天冬氨酸的糖氨酸，进一步证明此酶解方法的可靠性.表1对Pronase E酶解Chicken Albumin后得到的糖链的可能结构进行了归属.2.2 糖氨酸的Fmoc-Cl衍生反应目前，可用于糖链衍生化标记的试剂有很多，但存在反应方法复杂及反应条件较难控制等缺点，而对蛋白质的衍生化标记方法研究已经较为完善.由于实验中酶解后的糖氨酸带有—NH2活性基团，因此可借鉴蛋白质研究方法对糖链进行分析.常见的氨基酸衍生试剂有多种［17，18］，实验中选用Fmoc-Cl对糖链进行标记.Fmoc-Cl作为一种常用的柱前衍生试剂，具有衍生反应迅速、衍生条件温和及反应产物稳定等特点.在弱碱性环境下，Fmoc-Cl可与一级胺和二级胺同时作用［19］;另外，Fmoc-Cl在哌啶和DMF存在下，很容易从氨基上脱落［20］，得到原来的糖氨酸，这有利于对分离的寡糖做进一步分析.Fmoc-Cl衍生反应过程如图4所示.按照1.2.2节方法对从 Ribo B和Chicken Albumin上酶解下来的糖氨酸进行Fmoc-Cl衍生，衍生后的糖链的ESI-MS分析结果如图5所示.由图5（A）可知，m/z分别为1570.92，1732.92，1895.00，2056.64和2218.55的分子离子峰，其相邻主峰之间同样相差162，同Ribo B糖氨酸的质谱图［图2（D）］比较发现，衍生前后相对应的主峰分子量相差222，与糖链经Fmoc-Cl衍生前后的分子量差异一致，因此推断这些峰均为Ribo B的高甘露糖型糖氨酸Fmoc-Cl衍生物，并且质谱图中未检测到糖氨酸的分子离子峰，进一步表明衍生标记完全.图5（B）显示的是Chicken Albumin的Fmoc-Cl衍生产物，同Pronase E酶解Chicken Albumin后的质谱图［图3（B）］比较，相对应的主峰分子离子峰之间相差222，也表明Fmoc-Cl与Chicken Albumin糖氨酸衍生物反应完全.2.3 Fmoc-Cl衍生物的 LC-MS分析HPLC是寡糖分离的一种有效的分析手段，但由于完整寡糖链的亲水性强，极性大，不适于在常规的反相色谱柱上分离.而柱前衍生的方法可以使糖链带上紫外或荧光基团［6］，既能提高检测的灵敏度，同时又可以使糖链带上疏水基团，降低糖链的极性，使糖链在反相色谱柱上得到保留，便于糖链的分离.因此，实验中对Pronase E酶解获得的Ribo B糖氨酸Fmoc-Cl衍生物进行了HPLC分离及质谱的在线联用研究.实验中以不同体积比的乙腈和0.01 mol/L乙酸铵溶液作为流动相，考察了各种梯度洗脱、不同pH以及不同流动相流速对液相分析的影响，最终获得了最佳色谱条件.在该条件下，Ribo B糖氨酸的Fmoc-Cl衍生物达到了较好的分离，并且表现出强UV检测灵敏度（如图6所示）.HPLC与ESI-MS在线联用获得的相应的质谱图见图7.由图6可见，Ribo B糖链衍生物的HPLC图中出现了4个峰，ESI-MS实时检测捕捉到的MS图分别对应于图7中的（A）～（D），图6中的峰1对应于图7（A）中的质谱峰 m/z 1570.92［M+H］+和1587.67［M+NH4］+，推断与寡糖链衍生物 Man5-GlcNAc2-Asn-Fmoc-Cl的分子量一致;图6中峰2对应图7（B）中的质谱峰 m/z 1733.00［M+H］+和1749.92［M+NH4］+与 Man6-GlcNAc2-Asn-Fmoc-Cl的分子量一致;同上，图6中色谱峰3与图7（C）中的质谱峰 m/z 1894.92［M+H］+和 1911.92［M+NH4］+相对应，与Man7-GlcNAc2-Asn-Fmoc-Cl相应的分子量匹配;而在与图6中色谱峰4对应的质谱图7（D）中，出现了m/z 2056.82和2218.73这样相差162的分子离子峰，推断与Man8-GlcNAc2-Asn-Fmoc-Cl和Man9-GlcNAc2-Asn-Fmoc-Cl分子量一致，说明色谱峰4中包含有2条寡糖链，在选定分离条件下未能分开.由此可见，对由Pronase E酶解获得的糖链混合物用 Fmoc-Cl进行衍生后，可以在HPLC上进行分离和纯化.建立了一种由链酶蛋白酶E酶解、Fmoc-Cl柱前衍生以及HPLC-ESI-MS联用分析糖蛋白N-寡糖链的方法.该法通过控制链酶蛋白酶E的用量酶切多肽释放糖链，得到带一个天然氨基酸的糖链，在糖链上引入了—NH2活性基团，可以方便地利用氨基酸的荧光衍生试剂（如FITC，Fmoc-Cl和CY5等）对糖链进行标记，拓展了糖链分析的研究思路.本实验还实现了用Fmoc-Cl氨基酸衍生化试剂对获得的Ribo B和Chicken Albumin的糖氨酸进行标记，并对Ribo B糖氨酸衍生产物进行了HPLC-MS联用分析.该法对糖氨酸释放完全、衍生化效率高，且这种衍生试剂易于脱掉，有利于糖链的回收.在后续工作中还可将该法用于O-糖链的研究，进一步拓宽该方法的应用范围.同时，由于存在这种天然的糖链手臂，可将这一技术应用于糖芯片研究分析中，对研究糖与蛋白相互作用具有重要意义.【相关文献】［1］ Rudd M.P.，Elliott T.，Cresswell P.，Wilson I.A.，Dwek R.A..Science［J］，2001，291:2370—2376［2］ Ari H.，Aebi M..Science［J］，2001，291:2364—2369［3］ Lowe J.B..Cell［J］，2001，104（6）:809—812［4］ YAN-Qin（严钦），YU Hui-Qing（俞慧清），CHENG Guo-Xiang（成国祥）.Modern Immunology（现代免疫学）［J］，2008，2（28）:165—168［5］ Lee J.Y.，Park T.H..Enzyme and Microbial Technology［J］，2002，30（6）:716—720［6］ WANG Zhong-Fu（王仲孚），HE Jian-Yu（贺建宇），WEI Ya-Hui（尉亚辉），HUANG Lin-Juan（黄琳娟）.Chinese Journal of Organic Chemistry（有机化学）［J］，2006，26（5）:592—598［7］ Song X.Z.，Xia B.Y.，Stowell S.R.，Lasanajak Y.，Smith D.F.，CummingsR.D..Chem.Biol.［J］，2009，16（1）:36—47［8］Sǒrme P.，Kahl-Knutsson B.，Huflejt M.，Nilsson U.J.，Leffler H..Anal.Biochem.［J］，2004，334（1）:36—47［9］ Arlt K.，Brandt S.，Kehr J..Journal of Chromatography A［J］，2001，926（2）:319—325［10］ An J.H.，Peavy T.R.，Hedrick J.L.，Lebrilla 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IL-4、IL-13蛋白表达及抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选

IL-4、IL-13蛋白表达及抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选袁青;黄黎;郭夕源;叶迎春;年四季【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2013(029)006【摘要】目的:表达IL-4和IL-13蛋白,从人源单链抗体文库中分别筛选抗IL-4和抗IL-13单链抗体.方法:采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞(PBMC) mRNA中扩增IL-4和IL-13 cDNA;构建硫氧还蛋白融合表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定.以生物素化的IL-4和IL-13为抗原从前期构建的人源抗体文库中采用噬菌体展示技术分别筛选抗IL-4和抗IL-13人源单链抗体(scFv).结果:扩增的IL-4 cDNA大小为280 bp,表达的融合蛋白大小为27 kD左右.扩增的IL-13 cDNA大小为252 bp,表达的融合蛋白大小为25 kD 左右.分别以生物素化的IL-4和IL-13蛋白为抗原,采用噬菌体展示技术对人源抗体文库进行3轮富集后,分别有大约37％的scFvs与IL-4有结合特性,有约27％的scFvs与IL-13有结合特性.筛选了4株分别与IL-4和IL-13结合能力强的单链抗体进行了Westem blot鉴定和测序.结论:成功筛选到抗IL-4和抗IL-13人源性单链抗体.【总页数】5页(P644-648)【作者】袁青;黄黎;郭夕源;叶迎春;年四季【作者单位】泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000;泸州医学院基础医学院,泸州646000【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.抗IL－13全人源单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定 [J], 张登梅;年四季;叶迎春;杨燕;于红;袁青2.人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定 [J], 王凯;温伟红;王涛;张瑞;秦炜炜;雷小英;杨安钢3.抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定 [J], 周云;包林;金秋;张黎;蔡雪婷;卢悟广;曹鹏;焦永军;张建平4.人源Fab段噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选 [J], 胡占东;公倩;朱铁虹;畅继武5.人源抗转铁蛋白受体单链抗体的筛选及其构建与表达 [J], 佟振华;钱尼良;张晶;崔新玲;刘蕴慧;高新;宋海峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

PLZF_RAR_RAR_PLZF双阳性转基因小鼠发生白血病模型研究

血病 ( A PL ) 发病中的作用及发病机制。通过交配建立 PLZ F RAR /RAR PLZ F 双阳性转基因小鼠 ( TM )模型; 采
用 PCR、R T PCR 方法检测融合基因的整合和表达; 应用血象、骨髓象、病理和流式细胞术等对疾病表型进行检测分
析; 并观察全反式维甲酸 ( A TRA ) 或 ATRA 与 tr ico sta tin A ( T SA )联合用药对 PLZ F RAR /RAR PLZ F 双阳性转
基因小鼠骨髓细胞的作用。结果表明, 在近 18个月的时间观察到 51只 PLZF RAR /RAR PLZF 双阳性转基因小
鼠中有 5只小鼠发病, 发病率约 10% , 与我所同期的仅 PLZ F RA R 转基因阳性小鼠 11. 3% 的发病率相似。发病
时间均在 6月龄以后, 与 PLZ F RAR 转基因阳性发病小鼠相比示提前, 但疾病表型不同, 2只 ( 40% )为急性早幼
J Exp H em a to l 2005; 13( 6): 924- 931
基金项目: 国家自然科学基金资助 ( 30300139) ; 上海市博士后科研资助计划资助 ( 2003 - 16 ) 通讯作者: 陈赛娟, 院士、执行所长、医学基因组学国家重点实验室主任.21) 64743206. E m ai:l sjchen@ stn. sh. cn 2004 - 11- 29 收稿; 2005- 6- 6 接受
材料和方法
hCG PLZF RAR /hCG RAR PLZF双阳性 TM 模型的建立及融合基因表达的 RT PCR检测在以往的研究中已建成了 hCG PLZ F RAR 和 hCG RA R PLZF 两种转基因小鼠模型 [ 1, 2] , 质粒的构建是将 PLZ F RAR 和 RAR PLZ F克隆入 pUG hCG (人组织蛋白酶 G, hum an cathepsin G, hCG ) 载体, hCG 是调控 PLZ F RAR 和 RAR PLZ F 表达的微基因。小鼠的品系为 C57W T 与 CBA 杂交鼠。在此基础上分别将 hCG PLZ F RAR TM 4个家系 ( 01号、15号、23 号和 95 号 ) 与 hCG RAR PLZ F TM 3个家系 ( 02号、40号和 84号 ) 进行交配繁殖, 4周龄后剪取鼠尾组织 1 cm, 加鼠尾裂解液 450 l 及蛋白酶 K 50 l( 1 m g /m l) , 55 消化过夜, 平衡酚 - 氯仿抽提获得基因组 DNA, 检测融合基因整合情况。用半定量 RT PCR各设计 1对跨融合位点的引物, 采用 PCR 法检测。 18SRNA 为内参照, RT PCR检测融合基因表达方法见参考文献 [ 1, 2], 由于导入的 PLZ F RAR 和 RAR PLZF 是 cDNA, 为避免基因组 DNA 污染, 设计的引物跨越了载体 hCG 的第 1个内含子。

二硫键和巯基在蛋白质结构功能中的作用及分析方法

反式和反式扭曲反式构象。
如人血清清蛋白 ( H SA )是人血浆中水平最高的蛋白质。整个 H SA 分子富含半胱氨酸 ( 6% ), 除 1个半胱氨酸外, 其他半胱氨酸形成 17个二硫键。郭建宇等 [18] 通过单独测量清
蛋白拉曼光谱谱带和测量与 3 氨甲基吡啶作用后的清蛋白的谱带的实验证实: 在 502和 526 cm - 1分别有二硫键的特征峰, 通过峰的强度比值计算 H SA 的 17个二硫链有 12个为扭
3. 巯基的拉曼光谱表现及其应用对于巯基在拉曼光谱方面研究主要集中在含巯基的芳香族化合物上 [ 19] 。根据
李晓伟等 [ 20] 研究, 巯基与银反应生成牢固的 SA g键, 失去了
原有的特征性巯基氢键, 其光谱特点发生明显改变: 例如苯硫酚原本高频区位于 2 569 cm - 1的巯基谱峰完全消失, 与之相应在低频区 231 cm - 1处出现 SAg键的特征振动峰。
四、拉曼光谱技术在二硫键和巯基研究领域中的应用拉曼光谱技术早在 20世纪 30 年代就诞生了, 直到近年来共振拉曼光谱, 表面增强拉曼光谱, 傅立叶变换拉曼光谱等一系列新技术的出现, 才正式揭开了拉曼光谱在分子生物学领域应用黄金时代。 1. 拉曼光谱技术原理每一个不同的分子均有其独一无二的振动指纹, 这是现代振动光谱学的基础。拉曼光谱就是用一束光照射样品溶液或晶体来分析其散射的光子。处在基态的样品分子在受到一定能量的外来光子的激发后, 其能态上升至一个不稳定的中间状态, 样品分子在离开这个中间状态时随即辐射光子。如光子与样品分子间发生弹性散射, 则散射光频率与入射光频率相同, 称之为瑞利 ( R ayleigh) 散射; 如受激分子跃迁到一个较基态能量高的某一振转能级, 此时光子为非弹性散射, 损失能量, 散射光频率低于入射光频率, 称之为斯托克斯 ( S tokes) 散射, 反之, 如散射光频率高于入射光频率, 则称为反斯托克斯散射。拉曼实验通常应用的时斯托克斯效应。拉曼光谱中的这些非弹性散射的光子提供了与分子振动和转动密切相关信息, 反之, 这些信息

AUA、CCG、CCT、CTC、...

鹅源副粘病毒NA-1株M、NP基因原核与真核表达载体的构建及鉴定吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交学位论文,是本人在指导教师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。

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论文级别:■硕士□博士学科专业:预防兽医学论文题目: 鹅源副粘病毒 NA-1株 M、NP基因原核与真核表达载体的构建及鉴定作者签名: 指导教师签名: 年月日作者联系地址(邮编):长春市西安大路 5333号吉林大学畜牧兽医学院作者**************,S852.65.9.5作者姓名李娜论文分类号2006852061保密级别公开研究生学号学位类别农学硕士授予学位单位吉林大学培养单位专业名称预防兽医学畜牧兽医学院(院、所、中心)人兽共患传染病 2006年 9月至研究方向学习时间的诊断与防制 2008年 5月论文中文鹅源副粘病毒 NA-1株 M、NP基因原核与真核题目表达载体的构建及鉴定Expression and Identification of M and NP论文英文Gene of Goose-host Paramyxovirus Strain NA-1 题目in Prokaryote and Eukaryote关键词鹅源副粘病毒;NA-1株;M基因;NP基因; (3-8个) 原核表达;真核表达姓名丁壮职称教授导师情况学历学位博士工作单位畜牧兽医学院论文提交2008年 4月 24日答辩日期 2008年 5月 17日日期是否基金基金类别国家自然科学基金是资助项目及编号课题(30571375)如已经出版,请填写以下内容出版地出版者(机构)(城市名称名、省名)出版者地址(包出版日期括邮编)内容提要将本实验室分离、鉴定并纯化的鹅源副粘病毒 NA-1株进行了基因组 RNA 的提取,以 GenBank收录的鹅源 NDV ZJ1株全基因组核苷酸序列为模板设计2对特异性引物,通过 RT-PCR方法分段扩增了 M、NP基因核苷酸序列。

NOX-4调控PI3K信号通路参与TGF-β1诱导肺癌细胞表达Ⅰ型胶原蛋白

NOX-4调控PI3K信号通路参与TGF-β1诱导肺癌细胞表达Ⅰ型胶原蛋白董年;余垭妮;吴登敏;王蓓蓓;应赵建;裘丹萍;董莉;陈成水【摘要】目的:研究NADPH氧化酶4(NOX-4)调控PI3K信号通路在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肺癌细胞表达Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)的作用及分子机制.方法:体外培养人肺癌A549细胞,予TGF-β1刺激后,观察NOX家族和collagen 家族的mRNA和蛋白表达的变化,以及PI3K class Ⅰ催化亚基的表达和PI3K信号通路活化的变化;NOX-4抑制剂二亚苯基碘鎓(DPI)预先处理肺癌细胞,观察TGF-β1刺激后collagen Ⅰ的mRNA和蛋白表达的变化以及PI3K class Ⅰ催化亚基表达和PI3K信号通路活化.结果:TGF-β1可以诱导肺癌细胞中NOX-4和colla-gen Ⅰ的mRNA和蛋白表达升高,并诱导PI3K class Ⅰ催化亚基中PIK3CD表达升高和PI3K信号通路的活化. NOX-4抑制剂DPI可以抑制TGF-β1诱导的collagen Ⅰ表达升高;抑制NOX-4 并不影响TGF-β1 诱导的PI3K催化亚基PIK3CD表达,但可以降低TGF-β1诱导PI3K信号通路的活化程度.结论:NOX-4经调控PI3K信号通路的活化参与了TGF-β1诱导肺癌细胞表达collagen Ⅰ的分子机制. TGF-β1/NOX-4/PI3K信号通路轴在肺癌细胞collagen Ⅰ的表达中发挥了调控作用.%AIM:To investigate the regulatory effect of NADPH oxidase-4 (NOX-4) on PI3K signaling path-way in transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-induced collagen type Ⅰ (collagen Ⅰ) synthesis from lung cancer cells and the mechanisms. METHODS:Human lung cancer A549 cells were cultured in vitro and stimulated with TGF-β1. The ex-pression of NOX family and collagen family at mRNA and protein levels as well as the PI3K class Ⅰ catalytic subunits and the activation of PI3K signaling pathway wasmeasured. A549 cells were pre-treated with NOX-4 inhibitor diphenyleneiodo-nium (DPI), and the expression of collag en Ⅰ at mRNA level as well as the PI3K class Ⅰ catalytic subunits and the activa-tion of PI3K signaling pathway was measured upon TGF-β1 stimulation. RESULTS:TGF-β1 stimulated the expression of NOX-4 and collagen Ⅰ at mRNA and protein levels as well as the expression of PIK3CD and the activation of PI3K signaling pathway at a dose- and time-dependent manner. NOX-4 inhibitor DPI partly reversed TGF-β1-induced collagen Ⅰ expres-sion. Inhibition of NOX-4 down-regulated the degree of TGF-β1-stimulated activation of PI3K signaling pathway without effect on the expression of PIK3CD. CONCLUSION:NOX-4 participates in TGF-β1-induced collagen Ⅰ synthesis from lung cancer cells via regulating the activation of PI3K signaling pathway. TGF-β1/NOX-4/PI3K signaling pathway axis acts as a regulatory role in collagen Ⅰ synthesis from lung cancer cells.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2018(034)006【总页数】6页(P1014-1019)【关键词】转化生长因子β1;NADPH氧化酶4;PI3K/Akt信号通路;Ⅰ型胶原蛋白;肺癌【作者】董年;余垭妮;吴登敏;王蓓蓓;应赵建;裘丹萍;董莉;陈成水【作者单位】温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000;温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,浙江温州325000【正文语种】中文【中图分类】R329.28;R734.2肿瘤微环境由间质细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)共同构成，在肿瘤的免疫逃避、浸润转移和化疗耐药等恶性生物学行为方面发挥了重要作用,是肺癌5年生存率居高不下的原因之一[1]。