DNA指纹图谱与测序技术在中药品质鉴定中的研究概述

DNA指纹图谱与测序技术在中药品质鉴定中的研究概述O verv i ew on the Stud i es of D NA F i n ger Pr i n ti n g and Sequenc i n g Techn i ques i n Qua lit a ti ve D eter m i n a ti onof Ch i n ese Crude D rugs仇萍,盛孝邦,罗杰英(1.湖南正清制药集团股份有限公司,湖南　长沙　410015;2.湖南农业大学农学院,湖南　长沙　410128;3.湖南中医药大学,湖南　长沙　410007)[摘要]　DNA指纹图谱可从分子水平对中药材的种质进行准确的鉴定。

文章介绍了随机扩增多态性DNA技术、限制性片段长度多态性分析技术、mRNA差异显示技术、微卫星DNA技术、单核苷酸多态性技术在中药品质鉴定的应用。

[关键词]　DNA指纹图谱;测序技术;中药鉴定;综述[Abstract]　The DNA finger p rinting can identify the quality of Chinese crude drugs accurately fr om molecular level.The paper intr oduce s ome correlative techniques which were app lied in identificati on of Chinese crude drugs,such as random ly a mp lified poly mor2 phic DNA,restricti on frag ment length poly mor phis m,mRNA-differential dis p lay technique,Sequence-tagged m icr osatellites,single nucleotide poly mor phis m.[Key words]　DNA finger p rinting;Sequencing Techniques;I dentificati on of Chinese crude drugs;Su mmarizati on[中图分类号]R282.5　[文献标识码]A　[文章编号]1672-951X(2006)11-0077-03 中医药是中华民族对世界医学界的一项巨大贡献,它是一座巨大的宝库。

但是由于中药成分十分复杂,存在着难以定性定量分析,没有统一的质量标准,质量不稳定、难以控制等问题。

因此,国外对中药的看法是:有效成分不明,质量可靠性、质量可控性不够。

有的中药只是部分查明了有效成分,而且成分还会因产地、品种、采摘季节、气候条件、炮制等多种因素的影响而不同。

在有效成分不明确的前提下,用什么客观指标来保证中药质量?同时,中药是通过多成分、多途径、多层次、多靶点在人体内发挥整合作用,这些都给中药的深入研究和质量控制带来很大困难。

近年来,国内外学者一起致力于运用分子生物学的方法对中药进行研究,其中基因分析技术在中药分类、鉴别、资源利用等方面的应用是目前最令人鼓舞的进展之一。

通过基因工程的分析手段来获得中药的DNA指纹图谱,是近年来研究出的一种新的、便捷的、准确的分子标识鉴定方法。

据初步统计,我国有12807种中药,它们由于成分不同,而各有自己的特性,只要能获取每一种中药的DNA指纹图谱,便可将它们准确的鉴别出来,建立生药质量标准。

中药的鉴定是中药应用的首要工作,其意义和重要性日益突出而且亟待解决,这直接关系到中药各项研究工作结论的正确与错误和临床疗效的好坏。

中药的鉴定包括两个方面,一是中药材的真伪,二是质量的高低。

我国中药历史悠久,用于临床的大都是野生资源,在长期的进化过程中会发生各种各样的变异,从而造成资源混乱,在人工种植过程中,由于缺乏有效的鉴定,致使农民种植了伪品或混淆品,造成很大损失。

尤其是目前在中医药研究中的关键问题中草药的育种,更需要有真实可靠的资源保证。

近年来,运用分子生物学的技术和方法对植物药,尤其是中药进行研究引起了许多科研人员的关注。

通过基因工程的分析手段来获得中药的DNA指纹图谱,可以从分子水平上对药材的种质进行准确的鉴定。

1　随机扩增多态性DNA技术(Random ly Amp lified Poly mor2 phic DNA,RAP D)这是目前常用的DNA指纹图谱法,用随机合成或任意选定的单一引物在低温条件下与模板DNA序列随机的配对实现扩增,获得DNA指纹图谱,对研究对象的基因组DNA 做多态分析。

中国中医科学院中药研究所的曹晖是国内较早进行该课题研究的学者之一,他先后对苦地胆、蒲公英和人参等同它们的混淆品进行了比对、鉴别[1～5]。

李晓波[6]综述了1999年以前国内外基于PCR技术的中药DNA分子鉴别研究,重点论述了RAP D法和DNA直接测序法的应用,提出了DNA分子鉴别研究的思路与实验设计。

77黄芸等[7]用RAP D技术对射干类药材射干及混淆品鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等进行了分子水平的鉴定,用OP D-80等作随机扩增时,可得到识别这些物种基因组DNA 的多态性片段,RAP D法能有效地鉴别射干类药材,把射干和鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等药用植物区分开。

据对茅苍术、北苍术、关苍术和白术的挥发油化学成分分析发现,苍术类主要含苍术素(atractyl odin),而白术类主含苍术酮(atractyl on)。

《日本药局方》以此成分的差异作为白术与苍术的理化鉴别依据。

然而日本市售苍术商品药材中常常有白术的特异成分苍术酮,因此有人认为这是茅苍术和白术类植物杂交的结果。

Kohjyou ma等[8]采用RAP D方法对日本和中国野生或栽培的术类进行分析,发现日本栽培的茅苍术与中国产的RAP D指纹几乎一致。

虽然存在含较高苍术酮的茅苍术,但未显示茅苍术与白术或关苍术的杂交谱带,这表明茅苍术存在种内变异。

Nakai等[9]采用RAP D和PCR-RE LP方法对淫羊藿属8种植物进行了DNA分析,结果发现RAP D指纹较易区别中国特有箭叶淫羊藿和日本其他7种淫羊藿。

同时采用叶绿体基因组rbc L(引物间距约1.4kb)片断扩增后,用ScrF I酶解进行了RF LP分析,表明日本7种淫羊藿属内变异较大,与形态学结果不符。

动物龟板和鳖甲来源复杂,加之资源急剧下降,市场上龟板与鳖甲出现的混乱品种达15种之多。

而其鉴别特征不明显,进行真伪鉴定十分困难。

王亚明等从保存9年以上的药材龟板和鳖甲中提取DNA,并用线粒体基因组cyt-b基因(引物间距约500bp)通过PCR方法对龟板和鳖甲成功地进行了DNA指纹鉴定[10]。

此外,还有采用RAP D对溪黄草[11]、黄连属[12]、山麦冬属[13]、铁线莲属[14]、木蓝属[15]、蛇类[16]以及用PCR-RF LP 对人参属[17]、黄芪属[18]、海马[19]的DNA分析报告。

王培训等[20]运用RAP D技术对来自不同产地的西洋参样品进行多态性分析。

结果显示,大部分引物能扩增出清晰的DNA指纹图,西洋参真伪品之间的指纹图谱差异较大,而各地产西洋参DNA指纹图基本一致。

同时,发现个别产地产品的指纹图有不同程度的改变,考虑有变异可能。

于燕莉等[21]采用RAP D标记方法对山东临沂地区栽培的金银花两品系:大毛花金银花、鸡爪花金银花的DNA指纹图谱进行分析,试图从DNA分子水平上为两品系的鉴别提供依据。

实验结果表明:RAP D技术可有效地用于金银花品种的分类与鉴别。

刘文生等[22]采用RAP D技术扩增植物基因组DNA样品,获得清晰可靠的DNA指纹图谱,根据琼脂糖凝胶上显示的DNA带型差异可区分出厚朴、凹叶厚朴和其伪品、混淆品。

张庆芝等[23]比较了2000年版《中国药典》收载的黄芪品种及其民间西用品的DNA指纹图谱和有效成分黄芪甲苷、总黄酮机总多糖的含量,对黄芪质量标准进行多为研究,结果显示,DNA指纹图谱分析表明膜荚黄芪、蒙古黄芪和梭果黄芪有着较紧的遗传关系,而另外3种黄芪,即苦黄芪、黑毛多枝黄芪和直立黄芪有非常近的亲缘关系。

RAP D指纹图谱鉴别不仅被用于单味中药材,也被用于复方制剂中组成药的鉴别,如采用RAP D技术检测“玉屏风散”中的白术、黄芪、防风3味中药[24]。

2　限制性片段长度多态性分析技术(RF LP)将药材DNA用限制性内切酶消化后,进行限制性片段长度多态性分析,确定其基因的种属特异性,如苍术属药用植物的鉴别。

亦要对药材DNA的PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析,找出种属特异性来鉴别中药。

罗志勇等[25]采用扩增片断长度多态性DNA(AF LP)分子遗传标志技术,分析人参、西洋参基因组DNA多态性。

结果显示,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成功构建多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱。

虞泓,和锐等[26]采用AF LP技术对石斛属类石斛组4个种和1个外类群种进行基因组DNA多态性分析,结果显示,从64对引物组合中选出5对引物组合构建了5个种的DNA指纹图谱。

通过聚类分析,石斛属4种植物聚成一个大类,彼此间关系得到了很好的分辨,并获得bootstrap校验的有力支持,证明AF LP技术可用于石斛DNA指纹图谱研究。

3　mRNA差异显示技术(mRNA-differential dis-p lay tech2 nique,M rna-DD-PCR)这是一种新的、以标准PCR为基础的基因分析方法。

在动植物的细胞中,很多基因的表达有其特定的模式,即具有细胞或组织特异性。

通过将总RNA反转录成单链c DNA,进行PCR扩增,挑选出有差异表达的基因进行序列分析。

该技术有助于将野生植物与栽培植物、地道药材与普通药材之间的差异鉴别出来,因此在中药村的质量鉴定上应用前景广阔。

4　微卫星DNA技术(Sequence-tagged m icr osatel-lites)微卫星DNA技术即SSR,也可称为SSRP(Si m p le Se2 quence Repeat poly mor phis m s),其基本原理是根据与微卫星重复序列两翼的特定短序列来设计引物,用来扩增重复序列本身。

由于重复的长度变化极大,所以这是检测多态性的一种有效方法。

5　单核苷酸多态性技术(single nucleotide poly-mor phis m, S NP)同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异,因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。

目前S NP作为一种新的分子标记,已有2000多个标记定位于人类染色体上,在植物上也在进行开发研究。