地衣共生菌藻的分离与培养

地衣共生菌藻的分离与培养

地衣是一种真菌，由地衣共生菌和一种藻类或蓝细菌（蓝藻）的共生而形成的联合体，属“二元”生物体。在这个二元共生联合体中，真菌菌丝缠绕大量的光合细胞。在上述地衣的定义我们可以提出这样的一个问题：地衣是否可分为单个生物体？地衣生物学研究的许多方面均涉及到这些不同有机组织的相互作用。对于共生体的分离和培养研究，为科学家对于地衣共生关系本质的探讨提供了迷人的前景。该研究的中心问题是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培养，这也是解决地衣生理、形态、发育和分子生物学等方面研究的根本问题。

地衣共生体的培养曾经被认为难以进行，这主要是因为这是一项很耗时的工作，而且共生体的培养是否成功需要长期的技术探索。然而，Ahmadjian（1967b）突破性的研究引起了许多地衣学者对共生菌藻培养的兴趣。在过去的二三十年间，关于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相当的成就，如图一所示，地衣共生菌藻培养可以通过各种不

同的方法而实现。

地衣共生体的培养很难，即使用具富营养的培养基。主要是因为共生菌的生长远远快于共生藻或蓝细菌。此外，霉菌、酵母菌和细菌等的污染也是很重要的因素。因此在所有的操作过程中要进行无菌操作以防污染。

本章的目的在于讲述从地衣中分离出共生菌藻并进行培养的方案。子方案I讲述了地衣共生菌培养的各种方法。子方案II讲述了地衣共生藻培养的各种技术。这些培养技术已有报道，但我们在此研究的基础上又添加了一些新的内容。

关于共生体的分离技术已有Ahmadjian（1967a,b）和Galum（1988）全面的描述了。

子方案I 共生菌的培养

注意：除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上或无菌的条件下进行。所有的仪器在用之前都应高压灭菌（15~20分钟，121℃，1 atm）或干热灭菌（30分钟，180℃）。

一、仪器与材料

仪器：显微镜、解剖镜、相差显微镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生机、离心机、超净工作台或无菌工作室。

真菌来源：我们建议所用的地衣应为野外新采集的而且在一周内利用。然而地衣也可以在干燥状态下保存几周，或在冰箱内存放几年（Yoshimura et al. 1990)。共生菌可以从子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌体碎片中分离出来（Ahmadjian 1993）。

用来实验室培养最常见的共生菌分离方法是：孢子释放法，主要是子囊孢子。获得共生菌藻的另一个方法是解剖菌体切片，这样会形成大量较纯的共生菌，在第二章我们将详细介绍从菌体碎片中获得共生菌和藻的方法。

保存在Akita profectue University和Kochigakuen college的培养真菌可见表1。

（P7－13）。

真菌培养基：

Ahmadjian（1993）和Pyatt（1973）建议用来孢子收集和萌发的培养基应含营养量低。可在15℃黑暗条件下，采用含水4%的琼脂培养基以取得了较好的效果。这类共生菌的培养基如下：

WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基

琼脂4克蒸馏水补足100ml

MY培养基——麦芽酵母提取物培养基（ahmadjian 1967 a）

麦芽提取物20克酵母提取物2克

琼脂20克蒸馏水蒸馏水补足1000ml

LB培养基——Lilly and Barnett’ s培养基（Lilly和Barnett 1951）

葡萄糖10.0克天冬酰胺酸（Asparagine) 2.0克

KH2PO4 1.0克MgSO4•7H2O 0.5克

Fe（NO3)3•9H2O 0.2 mg ZnSO4•7H2O 0.2mg

MnSO44H2O 0.1mg 维生素B1（Thiamine) 0.1mg

维生素H（Biotin) 5ug 蒸馏水补足100ml

可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足1000ml，并制成固体培养基。

LBG 培养基——L illy and Barnett’s Gelrite 培养基

LB培养基中以1%的w/v Gelrite 代替琼脂。

注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前，应将所有培养基进行灭菌。

二、实验步骤

（一）通过孢子分离出共生菌

孢子释放：

1.把野外采集的地衣体洗净，放置几天使其于周围环境达到水分平衡。也可以将材料清洗和冷冻，在用之前平衡几个小时。

2.从地衣体上取下子囊盘或子囊壳，并将其在放有蒸馏水的培养皿中浸泡4小时或在流动水中清洗。通过挤压去除多余的水分。

3.将其用凡士林固定在皮氏皿底部，然后用含水4%的琼脂培养基盖在培养皿上部，将培养基放在培养皿的上面盖上，并防止琼脂污染。

4.确保琼脂在孢子的释放范围之内（大约5~10mm），释放的孢子会单个或成团的附着的琼脂的表面。如果要进行单孢子分离可以通过减少孢子的释放时间或增加子囊果同琼脂之间的距离；否则会得到的是孢子团。在适当的间隔（依据于释放时间，通常一天）多次的旋转琼脂层。另外在潮湿的环境中也可以释放到玻璃片上或无菌的薄膜上，然后用蒸馏水将孢子冲下，立即转移到培养基上。

5.用超薄膜将皮氏皿封口，在培养箱中进行培养，条件为无光、15℃。

6.为了检验孢子萌发情况，可以在相差显微镜下，观察孢子的释放情况。将释放的孢子转移到含有琼脂培养基的玻片上进行观察。保持皮氏培养皿玻片的潮湿，并连续观察。可以在水中或通过染色法（lactic-glycerol-cotton blue）观察孢子的萌发和菌丝体的生长情况。

孢子萌发和菌丝体生长：

有些地衣的孢子会在散出后的一天内萌发。

萌发后，将含有孢子的琼脂小块切下并转移到含有营养培养基的皮氏培养皿或试管中。

最常用的培养基为麦芽酵母提取物培养基MY培养基和LB培养基。

（二) 从地衣体中分离出共生菌。

由于有些地衣不产生子囊盘或成熟孢子，或者孢子萌发率低，这时候分离共生菌可用另外一个材料来源，如分生孢子（V obis 1997）或粉芽（Honegger and Bartnicki-Garcia1991；Hovegger et al. 1993)。由于裂芽经常被一些附生的微生物所污染，故不常用来分离共生菌。Yamamoto et al（1985）已经列出了采用地衣碎片分离出共生菌的方法。这可见于第二章。

1.用消毒的刮胡刀将新鲜的地衣切成薄片，然后存放于不含营养仅含水的小试管中或放在15℃环境下的潮湿的滤纸片上。然后将冲洗后的地衣体碎片在研钵中磨碎并加水混匀成悬浮液。经过滤后的滤液再经过第二次过滤。从第二次过滤的滤纸上取出少部分接种至斜面培养基上。新的髓状菌丝通常会在二三周后延长。采用无菌技术切取一部分新长出的菌丝，转移到试管培养基上。我们发现这种方法对于获的鹿蕊（Cladia rangiferina）和大叶梅（Paramotrema tinctorum）的共生菌很适用。

2.应当对此实验进行多次重复，以保证生长的真菌最有可能为共生菌而不是生长于地衣体表面或内部的其他真菌。