噬菌体的分离与纯化
大肠杆菌噬菌体的分离、纯化及其特性研究
１０ｎ 尾宽约 １ ２ ｉ 有尾鞘 、 ３ ｍ， ８— ２ｒ ｍ， 基板 、 尾丁 、 尾丝等结构 ， 该类噬菌体在污水中 占绝大多数． 三是短尾 噬菌体 ， 其头部
为二十面体 ， 大小为 ２ ｍ， ０ｒ 尾部长约 ２— ｍ， ｉ ３ｎ 在污水 中占有一定 的比例． ２种噬菌体在 一１ ￣ 冰箱可存活 ５ ８（ ２ ６天． 噬菌 经
体处理的污水 ， 总菌数下降了 ３ ％左右 ， ０ 大肠杆菌总数下降 ９ ％ 以上． ０
关 键词 ： 大肠杆菌； 噬菌体 ； 分离； 纯化； 特性
中图分类号 ： ３．８ Ｑ ９９４
文献标识码 ： Ａ
文章编 号 ： ３－ ７（０８ ￥－ ７－ ０ ８ ４９２０ ）２ ２３ ５ ４ ０ ０ ０
不衰 ， 已证 明利用 噬菌 体 可 以控 制 大肠 杆菌 引起 的 现 犊牛 、 仔猪 、 羔羊 的腹 泻 ， 治疗 大 鼠的大肠杆菌感 染 ， 在
１ 材 料 与方 法
１ １ 菌株来源及培养 ．
菌种 ： 大肠杆 菌（ ｃｉＣ Ｅ． ｌ ＭＣＣ（ ４ １３ 由厦 门 ｏ） Ｂ）４ ０ （
大学生命 科学学 院教学部提 供 ） 培养基 参 考文献 ［ ］ ， ７ 配制 ， ３倍 Ｌ Ｂ培 养基 ，Ｈ ． ７ ４ 其 中 Ｌ ｐ ７ ２— ． ； Ｂ底层 平 板培养 基加 ２ 琼脂 ， ％ 上层 培 养基 加 １０ ．％琼 脂 ．ＭＢ Ｅ 固体 培养基 ．
对鸡肉接种大肠杆菌的同时在鸡体不同部位注射噬菌 体， 则可保 护 鸡免 受 大 肠 杆 菌 的 感染 ．９２年 ，ｏｔｌ １９ Ｓｏｉ ｌ 发现 噬菌 体可 以保 护小 鼠免受 鲍 曼不 动 杆菌 、 脓假 绿 单胞菌的感染． 现在， 噬菌体在人、 鱼的传染性疾病 畜、 的防治方面发挥 着重 要 的作 用 ． 国 内， 在 自上 世 纪 ５ ０年代应用绿脓 杆菌 噬菌体 治疗 大 面积烧 伤病 人 ， 成 功地解 除 因耐药性 而 长期 不 能治 愈 的 问题 以来 ， 菌 噬
细菌的噬菌体分型
细菌的噬菌体分型实验二细菌的噬菌体分型第一部分肠杆菌科噬菌体的分离、纯化与增殖噬菌体广泛存在于自然界。
凡是有细菌存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。
例如，土壤、肥料、腐烂有机物、粪便和阴沟污水等常是各种细菌的栖息地，从中能分离到相应的噬菌体。
从自然界分离某一噬菌体需要经过以下步骤:培养宿主菌(或叫做敏感菌);采集含噬菌体的样品;噬菌体富集培养;制备噬菌体裂解液;验证噬菌体的存在;噬菌体的纯化;噬菌体的增殖;噬菌体的效价测定和保存。
下面以大肠杆菌噬菌体为例详细介绍噬菌体的分离和纯化方法。
1( 噬菌体的分离(1)制备菌悬液:取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
(2)增殖培养:于10ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶(1支5ml吸管)中，加入污水样品20ml(1支5ml吸管)与大肠杆菌悬液0.2ml(1支1ml吸管)，37?培养12h,24h以增殖噬菌体。
(3)制备裂解液:将以上增殖的混合培养液2500r/min离心15 min(1支5ml吸管)。
将上清液倒入无菌平皿，针管抽取液体，在针栓式滤器上过滤除菌。
所得滤液倒入灭菌瓶内，取少量滤液作无菌试验，即将它接入牛肉膏蛋白胨培养液中(1支5ml吸管、1支1ml吸管、1支无菌带帽华氏管)，置于37?培养过夜，以作无菌检查。
(4)噬菌体确证试验:滤液经37?培养过夜，若无细菌生长则表明已经彻底除菌。
需进一步证明噬菌体的存在。
于已烘干的肉膏蛋白胨琼脂平板(平皿1个)表面加一滴大肠杆菌悬液(1支1ml吸管)，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
放置数分钟，待琼脂表面干燥，在菌层的表面布点5个,7个，每点滴加上述滤液1小滴(1ml枪1把和枪头10个)，同时选择其中一点不加滤液只滴加一小滴生理盐水为对照，再放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
倒置平板，37?培养过夜。
次日观察结果，若平板上滴加滤液的部位出现噬菌斑，而在对照滴中处无噬菌斑，则表明该滤液中肯定含有大肠杆菌相应噬菌体。
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
1-3-3 实训 噬菌体的分离与纯化
（一）实训目的 • 学习分离纯化噬菌体的基本原理。 • 掌握纯化噬菌体的方法。 • 观察噬菌斑的形态和大小。
（二）实训原理 噬菌体广泛分布在自然环境中，在 其宿主存在的地方都可以找到噬菌体。 噬菌体对宿主有高度专一性，可利用 敏感菌株—宿主培养并发现它们；根 据噬菌体感染宿主并使之裂解，可在 敏感菌株(即宿主)的琼脂平板上出现 肉眼可见的噬菌斑，一个噬菌体可形 成一个噬菌斑，对此可进行计数。
④试验 上述滤液若无菌生长，可进行有、无噬菌体 存在的试验，其方法有试管法和琼脂平板法两种， 本实验用琼脂平板法。 • 步骤一：于肉汤琼脂平板上滴加大肠杆菌菌液一 滴，用无菌玻璃刮棒涂布成一薄层。 • 步骤二：待平板菌液干后，滴加上述滤液1小滴或 数小滴于平板上，再将此平板置于37℃培养过夜。 如滤液内有大肠杆菌噬菌体存在，即加滤液处便 无菌生长，而呈蚕食状的空斑。 • 步骤三：如已证明有噬菌体的存在，可再将滤液 接种于原已同时接种有大肠杆菌的肉汤内，如此 重复移种数次，即可使噬菌体增多。
（三）材料和用具 • 大肠杆菌斜面菌种(37℃，培养l8～24h)； • 上层肉汤蛋白胨琼脂培养基(含琼脂0.6%)， 底层肉汤蛋白胨琼脂培养基(含琼脂1.5%～ 2%)，三倍浓缩的肉汤蛋白胨培养基。 • 无菌吸管，无菌培养皿，无菌抽滤器，无菌 玻璃刮棒，三角瓶，恒温水浴箱，蔡氏细菌 滤器，真空泵，阴沟污水。
2.纯化 • ①滤液稀释 将含大肠杆菌噬菌体的滤液用 肉汤培养基按l0倍稀释法进行稀释，使成 5个稀释度。 • ②倒底层平板 用9cm直径的平皿5个，每 个平皿约倒l0mL底层琼脂培养基，依次标 明。 • ③倒上层平板 取5支各装有4mL上层琼脂 培养基的试管，依次标明。熔化后放于 50℃左右的水浴锅内保温，然后分别向每 支试管加0.1mL 大肠杆菌菌液和对号加入 0.1mL各稀释度的滤液，摇匀，然后对号倒 人底层琼脂平板上，摇匀铺平。
实验十一 从自然环境中分离纯化噬菌体
噬菌体分离和纯化的流程图
取20ml 水样 37℃ 振 荡培养 12-24h 离心收集 2500r/min 15min 上清 过滤
看板
分散滴 37℃ 过夜
加数滴
取 一 环
待 干 37℃过夜 培养 加0.1－0.2ml
EP管中加 0.9ml水
混匀 后取 0.2ml 加0.1ml 加0.1ml
立即倒 平板
③ 制备裂解液：将过夜培养物2500r/min离心15min，上清液用 无菌滤头过滤； ④ 确证实验：确证滤液中含有噬菌体的存在 在含有培养基的平板上加一滴大肠杆菌悬液，用灭菌涂布 器涂布均匀； 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面， 置于37 ℃培养过夜；如果在滴加处形成无菌生长的透明 的噬菌斑，证明滤液中含有大肠杆菌的噬菌体。
蛋白胨 10g/L
酵母粉 5g/L NaCl 10g/L
琼脂 0.7%
琼脂 2%
四、实验操作步骤
（一）噬菌体的分离
① 制备菌悬液：平板上挑取适量E. coli接入LB摇瓶中，过夜培 养制成菌悬液；
② 增殖培养：于10ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 加入20ml污水样品和1ml大肠杆菌菌液，37℃震荡培养 12~24h；
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液)。 2、培养基： LB琼脂平板(20ml培养基，2%琼脂，作底层培养基用)5个; 含琼脂培养基的试管(5ml，0.7%琼脂，作上层培养基用)5支。 3、仪器与其他用具： 含4.5ml无菌水小试管4支; 灭菌1.5ml Ep管 5个;
3、混合液加入到上层培养基中 (1) 将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5, 10-6,10-7和对照。 放置于48℃的水浴锅内。 (2) 分别将4管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中， 每加入一管就要立即摇匀。 4、上层培养基倒入底层平板上 (1)将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上，放在台面 上摇匀，使上层培养基布满平板。 (2)凝固后，置37℃培养过夜。
噬菌体分离纯化的原理和步骤
噬菌体分离纯化的原理和步骤1. 噬菌体简介好啦，大家，今天我们来聊聊一个有趣又神奇的东西，叫做噬菌体。
听起来像是外星人发明的玩意儿，其实它是一种专门攻击细菌的病毒，简直是细菌界的“灭霸”。
它们在微观世界中偷偷摸摸地工作，悄无声息地解决那些惹人烦的细菌问题。
咱们身边的细菌可不少，有的对我们有益，但有的却是个十足的“败类”。
这时候，噬菌体就像是细菌的天敌，真是太酷了！2. 分离纯化的意义2.1 为何要分离纯化噬菌体？那么，为什么我们要把噬菌体分离和纯化呢？首先，想象一下，如果你在一个大杂烩中找一颗珍珠，那可是相当困难的。
所以我们得把这些小家伙从杂乱的环境中“捞”出来，单独让它们站到聚光灯下。
这样一来，我们就可以更好地研究它们，了解它们是怎么攻击细菌的，有助于开发新的治疗手段，像是抗生素的替代品。
2.2 纯化的重要性再者，纯化的过程就像是给噬菌体洗澡，洗去那些多余的脏东西，只留下最纯粹的样子。
这样才能确保我们研究的数据准确，不然的话，可能会被一些“干扰分子”搞得一团糟。
想想，如果你的咖啡里多了一勺盐，那可就毁了整杯了，不是吗？3. 分离纯化的步骤3.1 收集样本接下来，我们来说说具体步骤。
第一步，得收集样本。
你可以从土壤、水源，甚至是一些腐烂的食物中找到细菌和噬菌体。
这可不是随便捞的，咱得选那些“鱼塘”丰富的地方。
想象一下，像在一片荒野中寻找“金矿”，可是比喻中的“金矿”得小心翼翼，别让细菌给我们添乱。
3.2 培养细菌收集好样本后，我们要把这些细菌培养起来。
通常用一些培养基，就像细菌的“自助餐”。
让它们在温暖的环境中肆意生长，像是细菌的“欢乐派对”。
可是咱可不能忘了，噬菌体也会趁机来“捣乱”，所以这时得时刻盯着它们的动态。
3.3 噬菌体分离一旦细菌培养得差不多了，就可以进行分离了。
这里可以用过滤的方法，把细菌和噬菌体分开。
想象一下，像是在过筛子，把沙子和金子分开，真是一场“筛沙子”的大比拼。
然后把留下来的液体提取出来，这里就大功告成了，噬菌体终于登场了。
噬菌体的纯化的注意事项
噬菌体的纯化的注意事项噬菌体的纯化是一种重要的实验技术，用于从混合细菌培养物中分离和富集目标噬菌体。
纯化噬菌体的过程相对复杂，需要注意许多细节和实验条件。
下面我将详细介绍噬菌体纯化的注意事项。
1. 预处理菌株：选择合适的菌株进行培养。
一般来说，应该选择易受感染的细菌菌株作为宿主，如E. coli。
同时，保证宿主菌株的健康和活力，要进行常规的培养条件优化，如温度、pH、培养基的配方等。
2. 噬菌体感染条件的优化：对于不同的噬菌体，感染条件可能有所不同，例如感染时间、感染菌液浓度等。
需要通过优化这些感染条件来提高噬菌体感染效率和产量。
3. 选择适当的抗生素：为了纯化目标噬菌体，可以选择一种或多种适合的抗生素来抑制宿主细菌的生长，从而让噬菌体选择性地感染宿主。
抗生素的选择应该针对宿主细菌对抗生素的敏感性进行测试。
4. 噬菌体感染的时间控制：感染细菌的时间应该精确控制，避免过长或过短。
过长的感染时间可能会导致噬菌体大量复制，而细菌丧失活力。
过短的感染时间则可能导致噬菌体产量过低。
5. 噬菌体的收集和处理：感染结束后，应将培养基进行离心，将上清液和沉淀分离。
上清液中含有噬菌体，沉淀中含有残余的细菌细胞。
这一步需要注意不要离心过高或过低，以避免沉淀的损失或噬菌体的污染。
6. 噬菌体的纯化方法：通常采用交叉过滤、密度梯度离心或亲和层析等方法进行噬菌体的纯化。
选择合适的纯化方法需要考虑噬菌体的性质、产量和纯度要求等因素。
7. 噬菌体的保存：纯化后的噬菌体应该进行适当的保存，以备后续实验使用。
常见的保存方式包括低温冷冻保存和分装保存等。
同时，还需要对噬菌体进行鉴定和检测，确保其质量和纯度。
8. 实验安全：在进行噬菌体纯化的过程中，要注意实验室的安全操作。
遵循实验室标准操作规程，采取必要的防护措施，如戴手套、眼镜等。
避免将噬菌体带出实验室，避免交叉污染。
总之，噬菌体的纯化是一项复杂的实验技术，需要仔细操作和严格控制实验条件。
噬菌体 生产 工艺
噬菌体的生产工艺主要包括以下几个步骤：
噬菌体的分离：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA（或RNA）在细胞体内进行复制、转录，相关基因表达，装配成完整的噬菌体颗粒，最后裂解宿主细胞或通过挤出方式从宿主细胞中释放出来。
因此，在液体培养基中可使浑浊的菌悬液变为清亮或较清亮。
利用噬菌体的这种特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养，噬菌体便能大量增殖，释放，从而可分离到特定的噬菌体。
纯化：通过离心、过滤、超滤、凝胶电泳等方法去除杂质和宿主细胞残留，得到纯化的噬菌体。
浓缩：通过高密度离心或超滤等方法对纯化的噬菌体进行浓缩，提高其浓度。
灭活：为了确保噬菌体的安全性，通常需要进行灭活处理，使其失去感染和复制能力。
常用的灭活方法有加热灭活、化学灭活等。
制剂制备：根据需要，将灭活的噬菌体制成不同的剂型，如注射剂、口服剂等。
在整个生产过程中，需要严格控制工艺参数和环境条件，确保产品质量和安全性。
同时，还需要进行质量检测和控制，确保生产的噬菌体符合相关标准和要求。
噬菌体实验差速离心法底部
噬菌体实验差速离心法底部摘要：1.噬菌体实验简介2.差速离心法原理3.底部样品处理与分析4.实验操作步骤及注意事项5.实验结果与应用正文：一、噬菌体实验简介噬菌体实验是研究病毒与细菌相互作用的重要方法。
通过该实验，我们可以了解噬菌体如何侵染细菌、复制和释放的过程。
在实验中，差速离心法是一种常用的分离病毒与细菌的技术，而底部样品则包含了实验过程中所需的各类物质。
二、差速离心法原理差速离心法是一种利用离心机对样品进行分离的方法。
通过调整离心机的转速和离心时间，使得不同密度的物质在离心管中形成不同的层次。
在噬菌体实验中，病毒、细菌和其它杂质因密度不同，可分别位于离心管的顶部、底部和中间层。
三、底部样品处理与分析1.底部样品中含有细菌、病毒和其他杂质，首先需要进行沉淀处理，去除上清液。
2.对沉淀物进行悬浮，然后进行梯度离心，进一步分离不同密度的物质。
3.收集底部沉淀物，进行病毒核酸提取和纯化。
4.对提取的病毒核酸进行扩增和测序，分析噬菌体基因序列。
四、实验操作步骤及注意事项1.实验前确保仪器设备和实验用品的清洁和消毒。
2.严格遵循实验方案，设置合适的离心条件和时间。
3.操作过程中轻拿轻放，避免剧烈震动，以免影响分离效果。
4.沉淀处理时，注意观察液体透明度，判断沉淀是否完全。
5.梯度离心时，注意观察离心管中物质的分层情况，确保达到预期分离效果。
6.实验结束后，妥善处理废弃物，遵循实验室安全规定。
五、实验结果与应用通过噬菌体实验差速离心法底部的分析，我们可以获得关于病毒、细菌和其他杂质的信息。
这些信息对于研究噬菌体的侵染机制、病毒基因工程和疫苗研发等方面具有重要意义。
此外，该方法还可应用于环境保护、食品安全和医学检测等领域。
总之，噬菌体实验差速离心法底部是一个富有挑战和价值的实验环节。
噬菌体制备流程
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噬菌体基因组提取方法
噬菌体基因组提取方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：噬菌体是一类侵染细菌的微生物，其基因组提取方法是研究噬菌体性质和功能的关键步骤之一。
噬菌体基因组提取的目的是获取噬菌体DNA，以便进行后续的分子生物学研究和应用。
本文将系统介绍噬菌体基因组提取的方法及其应用。
一、样品采集在进行噬菌体基因组提取之前，首先需要对需要研究的噬菌体进行样品采集。
样品可以来源于各种环境中的细菌样品，例如水体、土壤、动植物表面等。
在采样时需要注意样品的保存和运输条件，避免对噬菌体DNA的破坏。
二、细胞裂解细胞裂解是基因组提取的第一步，其目的是破坏噬菌体细胞壁和细胞膜，释放出噬菌体DNA。
传统的裂解方法包括化学裂解和物理裂解。
化学裂解使用蛋白酶、SDS等化学试剂破坏细胞结构，物理裂解则是利用高温、高压、超声波等手段使细胞破裂。
近年来，随着生物技术的发展，还出现了新的细胞裂解方法，如离心裂解、酶切裂解等，这些方法具有高效、低成本、易操作等优点。
三、蛋白质和RNA的去除在提取得到的细胞裂解液中，除了目标的噬菌体DNA外还会存在大量的蛋白质、RNA等杂质。
这些杂质会影响后续的DNA纯化和测序分析，因此需要进行去除。
通常采用蛋白酶和RNase酶对裂解液进行处理，将蛋白质和RNA降解分解，然后通过差速离心或柱层析等方法将杂质分离。
四、DNA的纯化经过蛋白质和RNA的去除后，得到的裂解液中含有目标噬菌体DNA。
为了获得纯净的DNA样品，需要进行DNA的纯化。
常见的DNA纯化方法包括酚/氯仿提取、硅胶柱纯化、磁珠分选等。
这些方法可以有效地去除残留的杂质，得到高质量的噬菌体DNA。
五、DNA的测序分析最后一步是对提取得到的噬菌体DNA进行测序分析。
目前，常用的DNA测序技术包括Sanger测序、next-generation sequencing（NGS）和第三代测序技术等。
这些技术可以对噬菌体的基因组结构、功能基因等进行深入的研究和分析，为噬菌体的应用研究提供重要的数据支持。
噬菌体侵染细菌的实验方法
噬菌体侵染细菌的实验方法一、实验前准备1.1 噬菌体的制备噬菌体可以通过多种方法制备，其中最常用的是双层琼脂法。
首先需要选择适合的宿主细菌，并在培养基中培养至对数生长期。
然后将噬菌体接种到宿主细菌中，使其进行感染，待细胞溶解后收集上清液即可。
1.2 细胞培养选择合适的宿主细菌进行培养，通常使用营养丰富的LB培养基或M9最小盐基础培养基等。
二、实验步骤2.1 噬菌体感染实验将目标宿主细菌接种于含有适量培养基的试管中，并在37℃下恒温摇床振荡培养至对数生长期。
将适量噬菌体加入到含有目标细胞的试管中，使其进行感染。
根据不同实验目的和要求，可以调整噬菌体和目标细胞的比例以及感染时间等因素。
2.2 病毒滴度测定病毒滴度测定是评估噬菌体感染效果的重要方法。
将一定量的目标细胞接种于含有适量培养基的96孔板中，并在37℃下恒温摇床振荡培养至对数生长期。
将适量的噬菌体加入到每个孔中，使其进行感染。
根据不同实验目的和要求，可以调整噬菌体和目标细胞的比例以及感染时间等因素。
最后通过滴度计算得出病毒滴度。
2.3 病毒扩增实验病毒扩增实验是将噬菌体在宿主细胞中进行复制和扩增的过程。
首先需要选择合适的宿主细胞，并在含有适量培养基的试管中进行培养。
然后将一定量噬菌体加入到试管中，使其进行感染。
根据不同实验目的和要求，可以调整噬菌体和宿主细胞的比例以及培养时间等因素。
2.4 病毒纯化实验病毒纯化实验是将混合物中的噬菌体分离出来，得到纯净的病毒制品。
首先需要收集感染后的上清液，并将其离心去除细胞碎片和杂质。
然后通过超速离心等方法将病毒分离出来，并进行洗涤和浓缩等步骤，最终得到纯净的病毒制品。
三、实验注意事项3.1 安全操作在进行噬菌体实验时需要注意安全操作，避免病毒泄漏和污染。
应该在生物安全柜中进行实验操作，并采取相应的个人防护措施，如戴手套、口罩等。
3.2 实验设计在进行噬菌体实验时需要合理设计实验方案，根据不同的实验目的和要求选择合适的宿主细菌和噬菌体品系，并根据需要调整感染时间、感染剂量等因素。
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体简介
噬菌体一、生物学特性噬菌体（Phage）属于非细胞型微生物，是侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒。
它们个体微小，通常仅能在电子显微镜下观察到；结构简单，多数噬菌体仅由蛋白质和核酸两种成分组成，蛋白质构成的衣壳包裹着核酸。
在自然界单独存在的噬菌体不表现出生命规象，但具有潜在的生命力。
噬菌体从吸附至宿主细胞上的一瞬间，就开始了自己的生命过程。
根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体。
烈性噬菌体通过吸附、侵人、生物合成、装配与释放等步骤使宿主细胞裂解死亡；而温和噬菌体侵染宿主后，则将其核酸整合在宿主基因组上，并以原噬菌体状态存在，宿主则转为溶原性菌株；但有时也有机率较少的温和噬菌体与烈性噬菌体一样，引起宿主细胞的裂解死亡。
温和噬菌体对溶原状态和裂解途径的选择，取决于感染细胞内的一些宿主基因产物和噬菌体基因产物活性之间的平衡。
[1]噬菌体广泛分布于自然界是与其宿主的广泛分布分不开的。
迄今为止，几乎没有一群细菌尚未发现其相应的噬菌体，只有那些我们了解的还很肽浅的细菌才尚未见其相应噬菌体的报导。
[2] 根据大小、形态结构特征，可以把噬菌体分为3种类型，一是蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体，其头部为二十面体，直径约110 -120nm，尾部长220-230 nm,尾宽13-15 nm,无尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构。
二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体，其头部为三十面体，约70nm x 110 nm，尾部长约120 -130 nm,尾宽约18-22nm，有尾鞘、基板、尾丁、尾兹等结构，该噬菌体似有包膜。
三是短尾噬菌体，其头部为二十面体，大小为20 nm，尾部长约2-3 nm。
[3]图1. 噬菌体生活周期二 噬菌体的繁育技术1. 繁殖方式噬菌体为非细胞型微生物，其增殖(复制)方式与细菌的繁殖(二分裂)方式不同，从吸附宿主菌到子代噬菌体的释放是一个爆发的过程，表现为“一步生长”的特点。
一步生长实验于1939年Ellis 和Delbruck 创立，据此可以测知噬菌体在细菌内增殖的潜伏期即每一个细菌产生噬菌体的平均裂解量。
噬菌体纯化注意事项
噬菌体纯化注意事项
噬菌体纯化是一种将噬菌体颗粒从细菌细胞中分离出来的过程。
在进行噬菌体纯化时，有一些注意事项需要注意：
1. 无菌操作：纯化过程中需要保持细菌和噬菌体的环境无菌，以防止细菌污染。
2. 保护噬菌体完整性：在离心、稀释和搅拌等操作中要小心，避免破坏噬菌体的完整性。
3. 控制温度：噬菌体纯化过程中，需要控制温度以维持噬菌体的稳定性。
通常，噬菌体纯化在4C下进行，以减少噬菌体降解的可能性。
4. 避免酶活性：噬菌体一般会包含一些限制性内切酶和外切酶，这些酶可能对DNA和RNA有活性。
在纯化过程中，需要避免激活这些酶，以免影响纯化结果。
5. 注意噬菌体寿命：噬菌体具有有限的寿命，因此应该尽快进行纯化过程，以避免噬菌体降解。
6. 合适的缓冲液选择：选择合适的缓冲液可以帮助维持噬菌体的稳定性和纯化效果。
一般情况下，选择pH适宜的缓冲液，并加入适当的保护剂以保护噬菌体。
7. 纯化步骤选择：根据具体的纯化需求，可以选择不同的纯化方法，如离心、过滤、柱层析等。
根据实际情况选择最合适的纯化步骤。
总之，噬菌体纯化是一个复杂的过程，需要注意以上几点，以保证纯化效果和噬菌体的完整性。
噬菌体作为载体的使用流程
噬菌体作为载体的使用流程1. 简介噬菌体是一种可以感染细菌的病毒，它可以被利用作为生物学研究和生物工程领域的载体。
在使用噬菌体作为载体时，有一系列的流程需要遵循以确保实验的成功进行。
本文将介绍噬菌体作为载体的使用流程。
2. 噬菌体的培养和扩增在使用噬菌体作为载体之前，首先需要培养和扩增噬菌体。
以下是噬菌体的培养和扩增流程：•准备培养基：根据实验需求，选择适合噬菌体生长的培养基，并准备好所需的培养基。
•制备噬菌体接种物：选择适当的宿主细菌，如大肠杆菌等，并将其在培养基中进行培养，直至细菌达到适当的生长状态。
•加入噬菌体：将培养好的噬菌体加入到宿主细菌培养物中，使其与细菌发生感染。
•培养噬菌体：将噬菌体和宿主细菌混合物在恰当的条件下进行培养，如温度、pH等。
•扩增噬菌体：通过适当的培养时间和培养条件，使噬菌体扩增至所需的数量。
3. 分离和纯化噬菌体在培养和扩增噬菌体后，需要对其进行分离和纯化，以获得纯净的噬菌体溶液。
以下是噬菌体的分离和纯化流程：•离心分离：将培养物进行离心，以分离噬菌体颗粒和残留的细菌细胞。
•滤过分离：通过使用合适的孔径滤膜，将噬菌体溶液进行滤过分离，去除杂质。
•超速离心：利用超速离心技术进一步分离噬菌体颗粒和溶液中的其他组分。
•超滤：通过使用适当的分子量切割膜，将噬菌体颗粒从溶液中分离出来。
•冻干与储存：将纯化的噬菌体溶液进行冻干处理，并储存于适当的条件下。
4. DNA插入纯化的噬菌体作为载体可以用于DNA插入。
以下是噬菌体的DNA插入流程：•DNA准备：从源中提取目标DNA，并进行适当的处理，如限制性酶切。
•DNA连接：将目标DNA与噬菌体载体DNA进行连接，通过适当的连接酶进行连接。
•转化：将连接好的DNA转化到适当的宿主细菌中，使其得到插入噬菌体的DNA。
•选择与筛选：通过选择性培养基或筛选方法，选出携带目标DNA的宿主细菌。
5. 噬菌体的扩增和提取将DNA插入噬菌体后，需要对其进行扩增和提取，以获得足够的目标DNA量。
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大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化
【实验目的】
1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】
1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：
（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；
（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；
（3）将样品内的细胞进行富集培养；
（4）制备噬菌体裂解液；
（5）检测噬菌体是否存在；
（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌
（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：
牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.
（2）牛肉膏蛋白胨培养液：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.
（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：
牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用
【实验材料及器皿】
1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水
3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
【实验方法步骤】
第一周：实验方案的讨论与完善
第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌
牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种
3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内
牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管做好标记
离心管12个（包好）
无菌水2管（3—4ml每管）
玻璃涂布器3个（包好）
将以上物品包好、做好标记，于121℃灭菌20min，对3个牛肉膏蛋白胨固体培养基搁斜面。
第三周：
周日下午
1. 接菌种：将大肠杆菌接种于搁号的斜面上（保留菌种）
2. 大肠杆菌的活化：挑取一环大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，（试管中）
3. 将大肠杆菌和敏感菌悬液于37℃恒温培养18h,备用。
周一中午
4. 取上述敏感菌培养液6ml至盛有50ml 3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养6h。
5. 将大肠杆菌菌种和剩余敏感菌培养液置于4℃冰箱保存备用。
周一晚上
6. 加污水100ml至敏感菌培养液和3×牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，于37℃恒温培养。
周二晚上
7. 制备裂解液：将以上增殖的混合培养液用2500r/min 离心30min,取上清液
8. 将上清液再次用2500r/min 离心15min,取上清液4℃保存备用。
9. 融化固体培养基、倒平板3个，先在平板表面滴加培养至对数期的大肠埃希氏菌菌液数滴，用无菌涂布棒涂匀。
带菌被平板培养基吸干后，在其上滴加上述上清液5-7滴于含菌平板表面，同时在同一平板的某区域上滴加无菌水对照。
10.将平板倒置于37℃恒温培养。
11.配置牛肉膏蛋白胨半固体培养基50ml，并按3.5ml每管分装到5个试管中，做好标记于121摄氏度灭菌20min。
周三下午：
12.观察平板，验证污水中是否有噬菌体（实验现象、结果见后面分析）
第四周：
周二晚上：
1、噬菌体样品的稀释：将已证明有噬菌体的上清液用牛肉膏蛋白胨培养液依次稀释为10-1，10-2，10-2，10-4，10-5 5个稀释度。
2、倒底层平板：取无菌培养皿5只，每个培养皿倒入约10ml牛肉膏蛋白胨琼脂培养基作底层，依次标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5稀释度。
3.制备上层混合液：制备噬菌体与敏感菌混合液，即在标明10-1，10-2，10-2，10-4，10-5共5支无菌试管中分别各加入0.2ml培养至对数期的大肠杆菌菌液，然后在各对应试管中加入相应稀释度的噬菌体液0.1ml后混匀，37℃保温5min，带噬菌体吸附侵入寄主细胞。
4.倒上层半固体琼脂平板：在上述各噬菌体和敏感菌的混合管中各加入3.5ml约50℃左右的上层牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基，立即摇动试管使培养基与菌液充分混匀，并对号倒在含有底层琼脂平板的表面，迅速铺平待凝。
5.培养：待上层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱中培养。
周三下午：
6.观察实验结果（具体结果见后面分析）
7.清洗整理实验用具。
【实验结果及分析】
1.大肠杆菌斜面结果：“z”型线清晰均匀，斜面结果较好。
分析：（1）培养基、斜面灭菌彻底，无杂菌生长。
（2）操作时严格按照斜面接种的方法进行。
2．验证噬菌体的存在的平板结果：
一、用枪加裂解液的平板（1个）：中央有大面积的透明区，周围有小部分的菌膜
二、用接种针加裂解液的平板（2个）：平板上出现明显的噬菌斑：透明，约8mm左右的圆形噬菌斑，对照区域无噬菌斑。
分析：
一、因所用的枪的最小量程为0.1ml，所以用枪加裂解液量过大，以致大面积的区域没有大肠杆菌，但周围有部分菌膜，说明有噬菌体存在，但既无噬菌斑有无对照，说服力不够强。
二、（1）平板上有噬菌斑，对照区无噬菌斑，充分证明所取材料中有噬菌体存在
（2）验证噬菌体存在时，滴加裂解液的量不宜过多，以免影响结果的观察从而影响判断。
3.噬菌体纯化的平板结果
平板表面没有成片的菌膜，也没有噬菌斑，但有分布基本均匀、为数不多的菌苔：呈直径约1mm左右的淡黄色圆形（5个平板现象一致）
分析：
（1）在验证噬菌体是否存在时，出现了明显的噬菌斑，证明所取材料中有噬菌体存在，噬菌斑的周围是大肠杆菌菌膜，同时也说明敏感菌悬液浓度合适。
（2）平板表面有少量菌苔，而前面已证明敏感菌悬液浓度合适，不是很低，说明有部分大肠杆菌死亡，而无噬菌斑出现，既说明死亡大肠杆菌不是噬菌体所致，也说明噬菌体死亡，所以应在操作步骤中找原因。
（3）在倒上层平板这一步中，半固体培养基在电炉上水浴融化后置于50℃的水浴锅保温，由于其他操作已经完成，实验时不够严谨，保温时间过短，大约3分钟就拿出来，直接加到上层混合液中，刚刚煮沸的半固体培养基在50℃的水浴锅中放置3分钟不足以使其自身温度降低至50℃左右，高温烫死了几乎所有的噬菌体和大部分的大肠杆菌，只有少数大肠杆菌存活了下来。
【实验心得】
由于不够严谨，致使实验结果不尽如人意，后续的实验，我们没再进行，说实话有点“不甘心”。
但本次综合实验意义重大，我收获不少，通过自己查阅资料、自己整理实验方案、自行安排并完成实验，使我对微生物甚至生物学实验有了系统的了解，通过具体的实验过程，更深入的掌握微生物学实验的基本原理和操作方法，培养自己的无菌意识，在今后的实验中应更加细心严谨，不断进取。