费氏弧菌β-内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(6):1029~1033*基金项目： 国家自然科学基金项目 （No.30370027； No.30350057） 资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 博士生导师。

主要从事木质纤维素的生物转化和酶分子体外改良的研究。

E­mail ： <lzd@>.收稿日期：2007­04­06 接受日期： 2007­05­17 ·研究论文· 费氏弧菌 茁 ­内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析 *王海青, 孟 欣, 洪玉枝, 刘子铎 **(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)摘要： 以费氏弧菌 （ ）EM17 基因组 DNA 为模板， 通过 PCR 方法克隆了该菌的 茁 ­ 内切葡聚糖酶基因 （Gen­ Bank 登录号:EF533943）。

将其插入到表达载体 pGEX­6p­1中， 转化大肠杆菌（ ） BL21 （DE3） 诱导表达。

测序结果经 DNAMAN 软件分析， 该基因与费氏弧菌 ES114基因组预测的 茁 ­ 内切葡聚糖酶基因同源性达到 97.1％， 但与其它 茁 ­ 内切 葡聚糖酶基因同源性较低。

酶学性质研究表明， 该酶的最适反应温度为60 ℃， 最适反应 pH 为 9.0。

同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在:Mg 2+ 和Ca 2+ 对酶有激活作用;Mn 2+ 和 Pb 2+则严重抑制该酶的活性。

关键词： 费氏弧菌； 茁 ­ 内切葡聚糖酶；同源分析； 酶学分析 中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:1006­1304(2007)06­1029­05Expression of 茁­endoglucanase Gene from in and Its Enzymological CharacterizationWANG Hai­qing,MENG Xin,HONG Yu­zhi,LIU Zi­duo**A gene encoding 茁 ­endoglucanase ( ) （GenBank Accession No.EF533943)from EM17was amplifiedby PCR and inserted into expression plasmid pGEX­6p­1.The recombinant plasmid was transformed intoBL21andinduced to express.Sequecing analysis showed that the sequence of 茁­endoglucanase gene fragment exhibited 97.1％ homology with ES114’ s ,while it was very low compared with other organisms.Enzymological characterization analysis showed that theoptimal enzyme reaction temperature was 60 ℃,and the optimal pH was 9.0.The result of the effect of ion on enzyme activity showedthat the enzyme activity relied on metal ion,Mg 2+ and Ca 2+ had a stimulating effect while Mn 2+ and Pb 2+had strong inhibitoryeffect.;茁­endoglucanase;homology analysis;enzymological characterization 纤维素是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物， 占植物干重的 35%~50% （王巧兰等,2004）， 又是自然界中数量最多的可再生物质 (Lynd., 1999)， 它的降解是自然界碳素循环的中心环节。

纤 维素的有效利用与转化对于解决目前世界能源危 机、粮食短缺和环境污染等问题具有十分重要的意义(Yang and Kasem ,2000)。

纤维素酶是指所有参与降解纤维素最终转化为 葡萄糖的各种酶的总称。

细菌纤维素酶是多酶复合 体系, 根据各酶的功能可分为三大类:(1) 内切葡聚 糖酶(endo­1,4­茁 ­D­glucanase,EC 3.2.1.4)。

作用于 纤维素内部的非结晶区, 随机水解 茁 ­1,4­ 糖苷键,将长链纤维素分子截短, 产生大量非还原性末端的小分子纤维素。

(2) 外切葡聚糖纤维二糖水解酶(exo­1,4­茁 ­D­glucanase ， EC3.2.1.91)。

作用于纤维 素线状分子末端, 水解 茁 ­1,4­ 糖苷键, 依次切下一 个纤维二糖分子。

(3) 茁 ­ 葡萄糖苷酶 ( 茁 ­1,4­glucosidase,EC3.2.1.21) 。

这类酶一般将纤维二糖或 可溶性的纤维糊精水解成葡萄糖分子（陈春岚和李 楠， 2007）。

产纤维素酶的微生物分布非常广泛，已知有几 十个属和一百多个种 (Coughlan and Hazlewood, 1993)， 包括细菌、 放线菌和各类真菌。

细菌产生的纤 维素酶量很低，主要是内切酶活性。

目前研究最为深农 业 生 物 技 术 学 报 2007年入的是丝状真菌， 它们能产生大量的纤维素酶， 尤其 以木霉属的产量居多。

费氏弧菌是一种生长在海洋中的革兰氏阴性 菌， 普遍存在于海洋环境及海洋生物体中， 它可以通 过细胞呼吸产物来发光。

任何对细胞代谢机制的抑 制作用都会导致其发光的减少，目前普遍地作为简 易的环境测试指标。

通过对费氏弧菌 ES114全基因 组测序，发现该菌中存在 茁 ­内切葡聚糖酶基因 （Ruby ,2005）。

鉴于该酶对纤维素转化中的重 要地位， 首次从费氏弧菌中克隆该基因， 并对其酶学 性质进行了初步分析， 为费氏弧菌 茁 ­内切葡聚糖酶 的理论与实际应用的研究提供了基本资料。

1材料和方法1.1 菌种和质粒费氏弧菌（ ） EM17为 Dr.Visick （Loyola University Chicago） 惠赠 。

大肠杆菌 （ ） DH5琢、表达宿主菌 BL21 (DE3)和载体 pGEX­6p­1为本室保藏。

1.2 试剂和培养基各种限制性内切酶， T 4 DNA连接酶为大连宝生 物有限公司产品， 蛋白质分子量标准、 DNA聚合 酶、 氨苄青霉素 （Amp） 和 IPTG购于上海生工生物 工程有限公司。

PCR产物回收试剂盒和凝胶回收试 剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品。

引物 合成和基因测序分别由上海生工生物工程有限公司 和北京三博远志生物公司完成。

其它试剂和药品皆 为国产或进口分析纯。

细菌培养采用 LB液体培养基，在液体培养基 中添加 1.5%的琼脂粉即为 LB固体培养基， 在需要 时加入 Amp至 100滋 g/mL。

1.3 方法1.3.1茁 ­内切葡聚糖酶基因的扩增 费氏弧菌 DNA的提取按照 Ausubel（1995） 的方法。

根据 费氏弧菌 茁 ­内切葡聚糖酶基因序列 （gi:59482313） 设计引物：EG­F： TTT ATGAAAATGCAATTAACGGTATTG，H玉ATG为起始密码子。

EG­R： CCC TTACTGACATACATTAACCCACTT，R玉TTA为终止密码子。

1.3.2茁 ­内切葡聚糖酶基因的克隆 PCR产物回 收后， 用 H玉和 R玉双酶切， 连接经同样双 酶切处理的表达载体 pGEX­6p­1。

转化大肠杆菌DH5琢， 随机挑取单菌落， 提取质粒验证。

将验证正 确的质粒命名为 pGEX­， 转化大肠杆菌 BL21。

1.3.3阳性菌的诱导表达 将带有质粒 pGEX­的大肠杆菌 BL21接于 5mL LB培养基中， 37 ℃培 养过夜， 按 1%的接种量转接于 200mL LB培养基。

至对数期加 IPTG至终浓度为 0.2mmol/L， 28 ℃诱 导培养 8h。

1.4 表达产物的 SDS­PAGE 电泳按照 Sambrook and Russell(2001)的方法进行。

1.5 β­ 内切葡聚糖酶酶活测定分别取费氏弧菌和经诱导的阳性菌菌液 200 mL， 10000r/min离心 5min。

菌体用 50mL PBS缓 冲液 （0.20g KCl， 0.24g KH2 PO4， 8.00g NaCl， 1.44g Na2HPO4， HCl调节至 pH7.4， 加水至 1L） 重悬， 用 超声波破碎细胞， 12000r/min离心 10min，所得上 清即为粗酶液。

茁 ­内切葡聚糖酶活性测定方法按林 远声和列璞怡 （2006） 的方法并稍做修改： 将 50滋 L 粗酶液加入 300滋 L pH5.0的 1%CMC­Na缓冲液 中， 50 ℃反应 30min后加入 150滋 L DNS，补水至1.5mL， 测定520值。

酶活单位定义为： 每分钟催 化底物产生 1滋 mol葡萄糖为一个活性单位 （U）。

2结果和分析2.1 β­ 内切葡聚糖酶基因克隆以费氏弧菌 EM17基因组 DNA为模板，扩增 得到 1条与预期大小 （1179bp） 一致的特异条带 （图 1）。

图 1.茁 ­内切葡聚糖酶基因的PCR扩增Fig.1.PCR amplification of茁 ­endoglucanase gene1， DL2000DNA marker； 2， 茁 ­内切葡聚糖酶基因 PCR产物。

1,DL2000DNA marker;2,PCRproduction of茁 ­endoglucanase.将阳性克隆质粒用 H玉和 R玉双酶切， 产生 1条与 PCR产物大小一致的片段，说明克隆正 确 （图2）。