基因工程课件

• 常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒 （plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外 的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：
翻译
蛋白质(性状)
密码子在生物界是 通用 的！
基因工程的产物
• 基因工程的概念
• 什么叫基因工程？
重组DNA技术是指将一种生物体（供体） 的基因与载体在体外将已知具有特定功能的核 酸分子插入细菌质粒、病毒载体中进行拼接构 成重组载体，然后转入另一种生物体（受体， 动物、植物、微生物）内，使之按照人们的意 愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体 外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受 体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
工具酶
内切酶 连接酶 DNA聚合酶 其他

限制性核酸内切酶
被称为分子生物学的手术刀，切断碱基之间 的磷酸二酯键。 发现： 1972年在大肠杆菌中发现。功能是切割外源 DNA，分三种。 只有第二种内切酶的识别序列和切割序列一 致，可以应用到分子生物学操作中。


1.主要来源： 主要从原核生物中分离纯化 ⒉种类与命名： ⒊作用特点： 识别双链DNA分子的某种特定核苷
酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷 酸之间的磷酸二酯键断开。

4.限制酶识别序列 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成 5.作用结果： 产生黏性末端或平末端

Go on
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。 粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ （Serratia marcesens） 大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R） 流感嗜血杆菌的d菌株 ( Haemophilus influenzae d ) 中先后分离到3种限制酶，则分 别命名为: HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ
基因工程
李海峰 2013年春
据WTO调查： 2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿 人，我国约6000万。
治疗糖尿病特效药—— 胰岛素
每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。 1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌 内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。
DNA(基因)
转录
mRNA
黏性末端
黏性末端
Go back
黏性末端
EcoRⅠ
黏性末端
重复演示
Go back
• 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
SmaⅠ
平末端
平末端
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限 制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这 种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基 化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上， 使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌 中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被 切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
Go back
磷酸二酯键
A
1
H
5 4
H
5 4
A
1
O
H
H
3HO
2
H2O +
3
2
H
5 4 3
T
1 2
H
5 4 3
T
1 2
H
H
O
限制性内切酶与DNA解旋酶的区别
限制酶
区别
DNA解旋酶
切割特定的核苷酸序列 将DNA两条链的氢键 的磷酸二酯键 打开形成两条单链
限制性内切酶与DNA水解酶的区别 限制酶
区别
基因工程的迅速发展阶段

自基因工程问世以来的这二十几年是基因工程 迅速发展的阶段。不仅发展了一系列新的基因工程 操作技术，构建了多种供转化（或转导）原核生物 和动物、植物细胞的载体，获得了大量转基因菌株， 而且于1980年首次通过显微注射培育出世界上第一 个转基因动物——转基因小鼠，1983年采用农杆菌 介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因 烟草。
Go back
• 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是 是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵， 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善 的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限 制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源 DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割 掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原 核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效， 从而达到保护自身的目的。
后 期 基 础 理 论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
1)基因转移载体的发现
2)工具酶的发现
3)DNA合成和测序技术的发明
4) DNA体外重组的实现
5)重组DNA表达实验的成功 6)第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明
思考?
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。 • 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两 者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合 成重组的DNA分子了。
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
后 期 基 础 理 论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
后 期 基 础 理 论
克里克等提出中心法则
复制
转录
翻译
DNA
逆转录
RNA
蛋白质
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
E· coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起 来，
T4DNA连接酶
迄今为止，所发现的DNA连接酶都 不具有连接单链DNA的能力，至于原因， 现在还不清楚，也许将来会发现可以连 接单链DNA的酶。



技术上的准备：20世纪60年代末70年代初，限制性 核酸内切酶和DNA连接酶等的发现，使DNA分子进 行体外切割和连接成为可能。1972年首次构建了一 个重组DNA分子，提出了体外重组的DNA分子是如 何进入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达等 问题。经研究发现，质粒分子（DNA）是承载外源 DNA片段的理想载体，病毒、噬菌体的DNA（或 RNA）也可改建成载体。至此，为基因工程问世在 技术上做好了准备。
抗虫基因
通过载体导入
转基因棉花有抗虫特性
• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤： 关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来 关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合” 关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞
目的片段的扩增
载体的选择
内切酶酶切
目的片段的回收
载体大片段的回收
连接酶连接回收产物
转化
抗性筛选，阳性克隆的分子鉴定
生物B基因片段 生物A基因片段 ……GAATTC…… ……GAATTC…………GAATTC…… ……CTTAAG…… ……CTTAAG…………CTTAAG…… 同一种 EcoRⅠ 酶切 ……G AATTC…… ……G AATTC…… ……G AATTC…… ……CTTAA G…… ……CTTAA ……CTTAA G…… G…… 不同来源的DNA片段混合 ……GAATTC…… ……GAATTC…… ……CTTAAG…… ……CTTAAG…… 将不同种来源的DNA片段连接起来
同裂酶和同尾酶： 同裂酶，是来源于不同物种但能识别相同 DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相 同也可以不同。如SmaI CCC GGG和XmaI C CCGGG。 同尾酶，即能切割产生相同末端的限制性内 切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制 酶。如SpeI( A CTAG T) 和XbaI(T CTAG A)。
DNA水解酶
切割特定的核苷酸序列 切割磷酸二酯键，形成 的磷酸二酯键，形成片 单个的脱氧核苷酸。 段的DNA.
Go back
• 限制酶的识别序列： 能被限制性内切酶特 异性识别的切割部位 都具有回文序列： 在切割部位，一条链 正向读的碱基顺序与 另一条链反向读的顺 序完全一致。
Go back
EcoRⅠ
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从 一种生物个体转移到另一种生物个体。
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
基因工程问世

在理论上和技术上有了充分准备后，于1973年， Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转 化，同时又与别人合作，将非洲爪蟾含核糖体基因 的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌， 转录出相应的mRNA。此研究成果表明基因工程已 正式问世，不仅宣告质粒分子可以作为基因克隆载 体，能携带外源DNA导人宿主细胞，并且证实真核 生物的基因可以转移到原核生物细胞中，并在其中 实现功能表达。
1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基 因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点 所处的位臵，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样 才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入 到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太 大就不便操作。