目标区域捕获测序 目标区域捕获文库制备

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HaloPlex目标区域捕获文库制备操作流程
1目的
本文件旨在规范HaloPlex目标区域捕获文库制备操作流程，提供相关标准。

2职责
实验操作人员在文库构建过程中，必须按照本标准操作流程操作，未经实验负责人允许，不得随便更改实验条件和操作方法，否则如果文库构建失败，将由实验操作人员负责。

3适用范围
1
本文件是基于Agilent HaloPlex目标区域捕获技术而制定的文库制备流程，所制备的文库适用于Illumina GA\HiSeq
2000 测序仪。

4术语和定义
无
5操作步骤
5.1 基因组DNA酶切
为方便实验操作，本SOP推荐进行12个样本的酶切反应，其中包括11个基因组DNA和1个Enrichment Control DNA
(ECD)样本。

在这一步，每个DNA样本会被平均分为8份，然后每份样本被2
种不同的限制性内切酶酶切消化，最后每个DNA样本会得到8份酶切消化后的混合产物。

5.1.1 每个基因组DNA样品，取225ng的总量至0.2ml的PCR管，分别用
ddH2O 稀释到45ul，终浓度为5ng/ul;另吸取45ul的ECD样本至额外的1个
0.2ml的PCR管。

5.1.2 配制RE Master Mix:
2
a.在1个1.5ml的EP管中加入476ul的RE Buffer和11.9ul的BSA Solution，震荡混匀并短暂离心。

b.准备一个新的8连管，分别加入56ul的RE Buffer/BSA mixture。

c.按照A-H的顺序，往8连管里面加入7ul的RE Enzymes(Green)。

d.同样按照A-H的顺序，往8连管里面加入7ul的RE Enzymes(Red)。

e.轻柔震荡混匀，然后稍微离心。

【注意】务必确保RE Enzymes(Green)和RE Enzymes(Red)的加样方向是一致的，否
则有可能导致酶切效果不佳。

5.1.3 准备一个新的96孔板，使用8道排枪向每个孔里加入5ul的RE Master Mix。

然后按照以下示意图，每列中分别小心加入5ul的DNA样本。

其中1-11列为不同基因组DNA样本S1-S11，12列为ECD样本。

5.1.4 封膜，小心震荡混匀，然后稍微离心。

5.1.5 在热循
3
环仪上(加热盖)37?C反应30min。

5.1.6 反应后通过对ECD样本的电泳分析验证酶切效果。

酶切后的ECD样品中分别每个取4ul到新的0.2ml的PCR管中，80?C灭活5min。

然后用Agilent 2100
对这8个ECD酶切产物以及没有反应的ECD样本进行检测。

反应完全的ECD酶切产物应该在125、225、450bp左右有3个明显的亮带。

备注:其中lane2-9分别为ECD酶切产物，lane10为未反应ECD样本。

【注意】不要在这一步就将1个DNA样本的8个酶切产物混合了。

如果在限制性内切酶
仍有活性的情况下将酶切产物混合，可能会导致不适当的酶切消化结果。

DNA 样本应该在杂交反应时混合，因为在该反应条件下，限制性内切酶是失活的。

5.2 HaloPlex探针杂交
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5.2.1 杂交反应体系:
5.2.2 按照上表的比例配好Hybridization Master Mix，震荡混匀，然后分别分装70ul至12个0.2ml的PCR管。

5.2.3 每个EP管里加入10ul不同的Indexing Primer
Cassette(见附录2)。

5.2.4 随后在每个EP管逐一加入相对应的DNA样本的8个酶切产物，震荡混匀并稍微离心。

【注意】限制性内切酶在该反应体系中是没有活性的。

对应的ECD样本，需额外加入32ul
的ddH2O。

5.2.5 在热循环仪上(加热盖)运行程序:先95?C变性10 min;然后54?C杂交3 h。

5.3 目标DNA捕获
事先取出Capture Solution, Wash Solution和HaloPlex
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Magnetic磁珠，平衡至室温。

5.3.1准备HaloPlex Magnetic
磁珠:
a.为每一个杂交反应取40ul HaloPlex Magnetic磁珠于一新的1.5mL离心
管，对于12个样本，则需500ul(含损失)。

b.将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液,并小心吸干残留;
c.加入等体积(500ul)的Capture Solution，重悬磁珠。

5.3.2从热循环仪中取出杂交反应管，立即往每个反应管中加入40ul已重悬的磁珠，上下吹打混匀，室温下静置15min。

5.3.3 简单离心，然后将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液。

5.3.4 取下EP管，每个加入100ul Wash Solution，上下吹打混匀，46?C下
静置10min。

5.3.5 简单离心，然后将EP管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液，并小心吸干残留，含磁珠的EP管留用。

5.4 缺口连接
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5.4.1 连接反应体系:
5.4.2 按照上表配好DNA ligation master mix，震荡混匀，然后分别分装
50ul至5.3中含磁珠的EP管中，上下吹打混匀。

5.4.2在热循环仪上55?C反应10 min。

5.5 洗脱DNA
5.5.1取出反应后的EP管，简单离心，然后放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液; 5.5.2取下EP管，每个加入100ul SSC Buffer，上下吹打混匀。

5.5.3简单离心后将EP管放于磁力架上，待液体变澄清后，去除上清液，并小心吸干残留。

5.5.4取下EP管，加入25ul新鲜配置的50mM的NaOH溶液，上下
吹打混匀，室温下静置1min。

5.5.5简单离心，然后将离心管放于磁力架上，待液体变澄清后，回收上清液至新的EP管中备用，此时含磁珠的EP管可弃掉。

5.6 PCR扩增
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5.6.1 PCR反应体系:
5.6.2 按照上表配好PCR master mix，震荡混匀，然后分别分装30ul至新的0.2ml的PCR中，并分别加入20ul洗脱后的DNA样本，上下吹打混匀。

5.6.3在热循环仪上(加热盖)运行以下程序:
a) 98 oC 2min
98oC 30sec
b) X cycles of
8。