肿瘤细胞传代实验操作
细胞周期与肿瘤抑制实验报告
细胞周期与肿瘤抑制实验报告引言：细胞周期是细胞在不断分裂和增长中经历的一系列有序的阶段，包括G1期、S期、G2期和M期。
这个周期对维持机体正常生长和发育具有至关重要的作用。
然而，在细胞周期的调控过程中，如果发生异常，可能会导致细胞无法停止增殖，甚至形成肿瘤。
因此，深入探究细胞周期调控机制对于肿瘤研究具有重要意义。
本实验旨在通过检测肿瘤抑制基因p53对细胞周期的影响，探究其在肿瘤抑制中的作用。
实验设计：实验选取小鼠模型，将小鼠胚胎纤维母细胞系（MEF）分为两组，分别是p53阳性组和p53阴性组。
在控制组中，不进行任何处理；在实验组中，通过转染技术将p53基因敲入MEF细胞。
通过对转染后细胞的观察和检测，来分析p53基因对细胞周期的调控作用，以及其在肿瘤抑制中的潜在意义。
实验过程：1. 细胞培养和传代将小鼠MEF细胞接种于预先处理的细胞培养板中，采用适当培养基进行培养，并定期进行传代，以保证细胞的良好生长状态。
2. 构建p53敲入载体根据实验需要，通过基因工程技术构建p53敲入载体，确保其能够成功转染至MEF细胞，并表达p53基因。
3. 转染实验将构建好的p53敲入载体转染至目标MEF细胞中，通过荧光染色等技术，观察转染效果和细胞的表型变化。
4. 细胞周期检测使用流式细胞术检测实验组和对照组细胞的细胞周期。
根据细胞核酸含量的变化，可以准确判断细胞所处的细胞周期阶段，并分析不同阶段的比例和变化情况。
结果与分析：通过对实验组和对照组细胞的观察和检测，得到了以下结果：1. 转染效果观察实验组中成功转染了p53基因的MEF细胞，观察到了荧光信号的发出，证明p53基因成功表达。
2. 流式细胞术结果分析在实验组中，相较于对照组，观察到细胞G1期比例显著增加，S 期和G2期比例明显减少，M期比例无明显变化。
这表明p53基因的存在使得细胞周期停滞在G1期，阻碍了细胞的进一步增殖。
讨论与结论：本实验旨在研究p53基因在肿瘤抑制中的作用，并从细胞周期的角度进行分析。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。
2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。
3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。
可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。
4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。
5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。
6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。
首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。
7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。
细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。
细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。
而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。
细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。
2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。
3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。
一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。
4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。
最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
细胞传代实验报告
细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规X和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基〔含10％小牛血清〕3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量〔剩余的细胞拿来做细胞计数〕，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
细胞迁移实验(细胞划痕法)
抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。
因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。
肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。
前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。
图1 肿瘤转移示意图根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。
异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。
肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。
通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。
当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。
间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。
针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。
其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。
下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。
其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。
由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。
在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。
肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。
最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。
有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。
Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。
同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。
2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。
铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。
3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。
4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。
5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。
6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。
各种细胞传代方法
das1977 wrote:【专题讨论】我还做过骨髓间充质干细胞（MSC）的原代及传代培养，下面谈谈我的传代步骤：1. 弃去旧培养液。
2.D-Hank's液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去D-Hank's液。
3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。
4.直接加含血清的LG-DMEM培养基（或血清)终止消化。
5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。
5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。
6.加入D-Hank's液吹打混匀，再离心一遍。
7. 用含10％小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，按1：2传代。
8.补加培养液至所用瓶容积的1/10为准。
9.送孵箱培养。
我也在做骨髓间充质细胞的培养，细胞培养的新手。
大鼠骨髓经ficoll分层后培养。
一周换液2次。
三周后，可以传代了。
然后大约7天可以传代一次。
跟das1977的方法稍微有点不同。
1. 弃去旧培养液。
2.预热的PBS液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去PBS3 加0.25%胰酶,0.05%EDTA于37度条件下消化，约两到三分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞缩成圆形漂浮为准。
我还用手轻轻击打培养皿的两侧，希望可以加速其消化。
实验室里的人都这么干，我就有样学样了。
：）4.直接加含10%的LM-aMEM培养基（或血清)终止消化。
5.我没有吹打细胞这个过程哦。
下次试试看。
但是结果还是不错的。
5. 离心5分钟（1200转/分钟），去上清。
6.加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。
7. 用培养液重悬细胞，按1：2传代。
有一次贪心，按1：4传代，结果细胞数太少了，没有一瓶长好的。
5555。
下次不能贪心了。
8. 补加培养液。
75cm2的，加10-15ml9.送孵箱培养。
我还培养了C2C12(购自ATCC),传代方法基本一致。
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。
一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。
用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。
也可以考虑动物媒介培养。
根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。
具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。
二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。
三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。
新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。
近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。
但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。
众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。
另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。
Hela肿瘤细胞培养操作规程
Hela肿瘤细胞培养操作规程一、实验准备1、细胞培养室的灭菌消毒细胞培养室及操作台用75%酒精擦洗3遍2、实验所需器材准备（1）移液器枪头的灭菌、烘干。
（2）3、培养基及溶液的配制PBS溶液的配置：培养基的配置：二、细胞的复苏操作1、把冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出来后，立即37℃水浴，同时轻微摇动。
待液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2、把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3、把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5、3天换一次培养基。
三、细胞的传代1、培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2、把原有培养基吸掉。
3、加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4、细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5、用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6、把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7、倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8、根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。
继续培养。
四、冻存细胞消化下来并离心（同上）。
用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分把钟，写明细胞种类，冻存日期。
4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
要注意的就是无菌操作！培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器。
用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。
在超净台内过滤。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
肿瘤细胞培养
肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养是医学研究中重要的实验手段之一，它可以提供大量的肿瘤细胞用于进一步的研究。
本文将介绍肿瘤细胞培养的基本步骤和技术要点。
一、肿瘤细胞培养的基本步骤1. 细胞准备：选择合适的肿瘤细胞株，并从冷冻保存状态中复苏。
确保培养皿和培养试剂的无菌，准备培养基以提供适宜的细胞生长环境。
2. 细胞接种：将肿瘤细胞接种到培养皿中，控制接种密度和接种体积，使细胞能够充分附着并快速扩增。
3. 细胞培养：将接种成功的细胞放置于恒温培养箱内，提供适宜的培养条件（如温度、湿度和二氧化碳浓度等），定期更换培养基以维持细胞的正常生长。
4. 细胞观察：定期观察和记录细胞的生长情况，包括细胞数目增长趋势、细胞形态和细胞的附着情况等。
5. 细胞传代：当细胞密度达到一定程度时，需进行细胞传代以避免细胞因长时间培养而导致的突变或凋亡。
传代时需要使用胰蛋白酶等相关试剂进行细胞的离析和分散。
二、肿瘤细胞培养的技术要点1. 培养基选择：不同类型的肿瘤细胞对培养基的要求有所不同，因此应选择适宜的培养基。
一般情况下，培养基中应包含足够的营养物质和生长因子，同时控制培养基的pH值和温度。
2. 细胞密度控制：细胞密度对于细胞生长和代谢活性具有重要影响。
过高的密度会导致细胞周围缺氧和养分不足，过低的密度则无法维持细胞生长。
准确控制细胞密度可以提高细胞培养的成功率和生长速度。
3. 细胞消毒：细胞培养过程中，细胞容易受到外界的污染。
因此，在进行细胞接种和传代时，需要严格遵守消毒操作规范，使用无菌器材和试剂，并且定期对培养箱和操作台进行消毒。
4. 细胞分化和标志物检测：某些肿瘤细胞在培养过程中可能会发生分化现象，失去肿瘤特性。
因此，需要进行细胞的标志物检测，以确保细胞仍保持原始的肿瘤细胞特征。
5. 质量控制和质量保证：肿瘤细胞培养需要严格遵循实验室的规范操作流程，并进行质量控制和质量保证。
细胞培养过程中应定期检测培养皿和培养基的无菌性，避免外界因素对实验结果的干扰。
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤
肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞原代培养实验具体方法及步骤肿瘤细胞的原代培养与正常细胞的原代培养的条件基本相似。
一般常用原代细胞的基础培养基，10%血清浓度即可，在原代培养时需加入原代细胞培养的特制添加物，或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。
用细胞生长因子如胰岛素、氢化可的松、雌激素等等。
也可以考虑动物媒介培养。
根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子。
具体步骤一、将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分。
二、在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1-2 mm3小块。
三、接种于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
注意一、注意污染1、严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。
新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
细胞计数可在有菌环境中进行。
3、吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。
凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
二、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。
总结经验一、对肿瘤细胞系或细胞株的评价已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。
近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。
但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。
众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。
另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。
肿瘤药理实验方法
●人体肿瘤动物体内移植模型的建立 ●实体瘤动物体内移植模型的建立 ●非实体瘤动物体内移植模型的建立
移植性动物肿瘤模型
实体瘤动物体内移植模型的建立
●主要特点
小块瘤体接种法
●接种方法 肿瘤细胞悬液接种法
培养细胞动物体内移植法
●瘤体测量方法
实体瘤动物体内移植模型的
主要特点
1.一群动物同时接种等量同种癌细胞，肿瘤生 长速度比较一致，个体差异较小；
瘤块，剔除其他组织后称重。若对照组小鼠肿瘤
平均小于1g或20%小鼠的瘤重小于400mg，表 示肿瘤生长不良。在治疗期间给药组小鼠死亡率 大于20%或平均体重下降 (自身对照)超过15%者， 表示药物毒性反应，应适当减量重复试验。
比较试验组与对照组瘤重的差异，按下列公式 计算肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率＝
对照组瘤重－给药组瘤 对照组瘤重
在无菌条件下操作。
肿瘤细胞悬液接种注意事项
1.研磨方向及转速 制备肿瘤细胞悬液时，在人工研磨时必须使
研磨杆向同一方向转动，不可反向交替研磨，防 止磨破肿瘤细胞；如果采用电动研磨，一定要控 制好转速，以免破坏完整的肿瘤细胞。 2.细胞数
细胞数多少适中，如果瘤细胞数过多，接种 后瘤体生长过快，不便于药物作用的观察；瘤细 胞数过少，会导致接种失败，接种部位不能形成 肿瘤。接种失败后再在原动物体内重新接种也难 成功，必须重新更换动物。（为什么？）
MD＝ A B C ×100% 3
MD为肿瘤平均直径；A、B、C为实体肿瘤3 个相互垂直的直径，一般用毫米为单位。由于测 量的厚度包括皮肤在内，故瘤体越小，产生的误 差也就越大。注意由同一实验者测量。
动物肿瘤体内实验方法
移植性动物肿瘤模型
t25细胞传代实验步骤
t25细胞传代实验步骤
1. 准备实验材料:
- 细胞培养液(含10%胎牛血清)
- 磷酸盐缓冲溶液(PBS)
- 胰蛋白酶-EDTA溶液
- 新鲜培养皿(T25)
- 吸管
- 离心管
- 细胞培养箱
2. 取出待传代的细胞培养皿,在无菌操作台上,用移液枪吸去旧培养液。
3. 用PBS轻轻冲洗细胞层2-3次,以去除残余培养液和死细胞。
4. 加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液,覆盖细胞层,置于37℃培养箱内5-10分钟,待细胞脱离培养皿底部。
5. 加入新鲜培养液终止胰蛋白酶的作用,用移液枪轻轻吹打细胞悬液,使细胞充分离散。
6. 将细胞悬液转移至离心管中,1000rpm离心5分钟,沉淀细胞。
7. 弃去上清液,用新鲜培养液重新悬浮细胞。
8. 根据细胞密度,取适量悬液接种于新的T25培养皿中,加入适量新鲜培养液。
9. 轻轻旋转培养皿使细胞均匀分布,置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
10. 每2-3天检查一次细胞生长状况,及时更换培养液。
待细胞生长密度达80%时,再次传代。
注意操作无菌,避免污染。
实时观察细胞状态,保持最佳培养条件。
成瘤实验 研究依据的实验标准、技术指南
成瘤实验研究依据的实验标准、技术指南成瘤实验是生物医学研究中常用的实验方法之一，用于研究肿瘤的形成、生长、转移和治疗效果等问题。
在进行成瘤实验时，通常需要基于一定的实验标准和技术指南，以保证实验的科学性、准确性和可重复性。
本文将就成瘤实验的实验标准和技术指南进行详细的介绍。
一、实验标准在进行成瘤实验时，需要遵循一些基本的实验标准，以确保实验流程的规范性和科学性。
这些实验标准可以分为以下几个方面：1.动物实验伦理：成瘤实验通常需要使用动物模型，因此一定要遵循相关的动物实验伦理规范。
这包括确保动物的福利和权益，遵循合理的动物实验操作流程，以及获得相关伦理机构的批准等。
2.实验设计和样本统计：成瘤实验的设计应遵循科学原则和统计学原则。
需要合理确定实验组和对照组的设置，具体的样本数和实验重复次数，以及实验的随机化、盲法和对照设置等。
3.实验操作和数据记录：进行实验操作时，应严格按照实验计划和操作手册进行，确保实验的可重复性和数据的准确性。
同时，还要规范实验数据的记录和存储，以备后续的数据分析和验证。
4.实验器材和试剂：选择合适的实验器材和试剂对于成瘤实验的结果具有重要影响。
需要确保实验器材和试剂的质量符合规定标准，而且使用过程中不会对实验结果产生干扰或污染。
二、技术指南成瘤实验的技术指南主要针对实验的具体操作和数据分析等方面，以下是常用的技术指南：1.细胞培养和传代：在进行成瘤实验之前，通常需要培养和传代肿瘤细胞系。
这需要按照细胞培养的基本原则和相关技术指南进行，例如合适的培养基选择、细胞密度的调整、传代时间的确定等。
2.细胞引种和移植：在进行成瘤实验时，通常需要将肿瘤细胞通过某种途径引种到动物体内。
这涉及到细胞注射的技术和方法，需要注意注射位置、注射剂量和注射方式等。
3.肿瘤观察和测量：进行成瘤实验后，需要对肿瘤的生长情况进行观察和测量。
这包括测量肿瘤体积、质量和生长曲线等指标的变化，确保数据的准确性和可比性。
高级病理学：肿瘤的动物实验方法
终止后2-3个月，29个小鼠中４个癌 前病变，4个癌瘤。
（四）应用放谢线等辐射引起实验肿瘤 的方法
1、“X”线照射：
（1）6,500 ~ 13,000伦→照射大鼠骶部时， 前剂量 → 溃疡性“X”射线皮炎 后剂量 → 肉瘤
（上述实验亦可由放射性磷引起）
2、注入放射性物质或辐射 引起皮肤癌、肉瘤、白血病等。
3、日光照射及紫外线照射 日光照射：每天7小时——6-7个月，600小
时以上，裸露部分的皮肤癌变↑↑ 照射剂量增加，癌发生提前,多数量为生
27 - 28大卡 11-15个月出现
33.3大卡 8个月出现
41大卡 耳、鼻、足部、眼部出现
移植瘤甲胎蛋白白蛋白前白蛋白转铁蛋白在人休内证明这种蛋白的产生是困难的但利用裸鼠移植做这方面的研究工作是完全可能的大星等建立了一种胃原发的绒毛膜上皮细胞癌的裸鼠移植瘤株这个瘤株hcg还可产生雌激素孕酮和胎盘性催乳素胎盘性碱性磷酸酶患鼠性腺和乳腺呈现妊娠性变化机能性肿瘤functioningtumor3各种治疗方法的研究1化学药物的筛选
（2）保持了原发瘤的特异蛋白，激素分泌及其 它功能
肝癌、肝母细胞癌 → 甲胎蛋白 结肠癌、直肠癌 → 癌胚抗原 肾癌、肝癌 → 促红细胞生存因子。 绒毛膜上皮细胞癌 → HCG 部分胃癌 → 雌激素受体，铁传递蛋白受体
（3）染色体核型： 保持了人染色体核型——“X“型 （而裸鼠染色体核型——“Λ”型 ） （4）保持了人原发瘤的抗原性 （5）保持了人原发瘤对抗癌药的感受性
肿瘤的动物实验方法
一、肿瘤动物实验的途径：
主要途径有三个 1、自发—— 获得足够大量的动物的自发性肿瘤病例 2、诱发—— 使用各种化学物质或辐射在动物身上引起肿瘤 3、移植—— 将自发或诱发的肿瘤从一个动物接种到另一动
传代培养流程
传代培养流程传代培养是一种将细胞分离、生长和扩增的过程，通常用于生物学、医学、药学研究等工作中。
传代培养可适用于许多类型的细胞，包括原代细胞、肿瘤细胞、以及转染后的细胞等。
一、准备工作a. 确定培养基配方：选择合适的培养基配方，根据细胞类型需求添加必要的生长因子和营养物质，如未必要可加入一定浓度的抗生素。
b. 消毒培养器具：所有的器具（离心管、培养皿、细胞培养瓶等）都需要在使用前彻底消毒，并在操作和运用过程中维持消毒状态以杜绝细菌、病毒污染。
c. 收集细胞：取得即将扩增培养的原代或继代细胞，若为老化细胞需要从一组新的、活性高的细胞中取得。
d. 设置细胞密度：在接种之前，我需要对细胞进行计数并要确保它们以适当的密度培养。
这通常意味着将适当的细胞数量计入培养器中，以便在24-48小时内扩增到所需的数量。
二、分离细胞a.用一种含有胎牛血清的培养基精细地分离细胞，即细胞生长基质的血清可以帮助细胞的黏附和扩增，确保细胞在适当的生长条件下茁壮发展。
b. 运用试管、掏子、胶片和其他适当器具，分离细胞，并将其分散在合适的培养基中，以便让它们快速生长和扩增。
c. 若需继续扩增，则重复上述操作，将细胞继续放置在培养基中，直到达到所需细胞密度。
三、培养细胞a. 将皿或瓶放置于恰当的温度下，通常在37°C的培养箱中，以便在最佳的生长条件下扩增细胞。
b. 保护细胞：在培养细胞的过程中保护它们不受污染或其它环境因素的危害，如避免长期的紫外线照射，避免细胞干燥。
c. 注意观察：定期观察培养细胞的生长和健康程度。
在适当的时间间隔内（24-48小时）更换培养基，并将细胞移至新的培养皿中，以便继续扩增。
四、细胞冻存a. 非常重要的是，维护一些质量良好的细胞样本以备不时之需。
因此，在将细胞用于实验之前，要进行细胞冻存以备不时之需，也可以方便将细胞共享给其他研究者。
b. 进行细胞冻存需要选取逐代生长较活跃、状态稳定和细胞恢复能力较好的细胞。
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肿瘤细胞传代实验操作
1．实验前，准备好超级新生牛血清、0.25%胰酶、培养基、酒精灯、酒精棉、5ml培养瓶、枪头，移液枪、移液管、弯头管和50ml离心管。
超净工作台紫外灭菌20-30min。
2. 摆放好要用的物品，用75%酒精擦手消毒，手干后再点燃酒精灯。
3．依次打开培养基、胰酶和血清，每打开一个试剂瓶盖都要在酒精灯外焰灭菌，打开后瓶口也要用酒精外焰灭菌，放置在超净台内侧，手不容易碰到和经过的地方。
4．用弯头管吸出旧培养基，加入3ml胰酶，将胰酶覆盖全部细胞，3min后观察细胞消化状态。
5. 待细胞消化到从屏瓶壁脱落时，用弯管清洗掉瓶内细胞，吹打细胞为单个细胞，小心转移入离心管，1000rpm/min速度3-5min。
6. 小心拿出离心管，在酒精灯火焰周围打开离心管盖，用枪头小心吸取上清弃去，加入新DMEM培养基，10%超级新生牛血清，一分为二。
7．盖上瓶盖，标记日期、培养人和细胞种类，放入恒温培养箱中（37℃，5%CO2），放入时将瓶盖拧松半圈，保证细胞呼吸CO2，定时观察。
注意：手尽量不直接接触物品，尽量都用移液管和枪头操作。