植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶试剂盒使用说明
辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒使用说明
取上清液冰上保存供测定 NADPH 含量。
二、测定步骤(在 1.5mLEP 管中按下表依次加样):
试剂名称
测定孔(μL)
样本
50
双蒸水
试剂一
250
试剂二
75
试剂三
75
试剂四
75
试剂五
35
对照管可以只做一个,不需每一个样品都做一个对照。充分混匀后,室温避光静置 40min
2、组织中 NADP 和 NADPH 的提取:
称取约 0.1g 组织,加入 0.9mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min,冰浴中冷却后,10000g
4℃离心 10min,取上清液至另一新的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,10000g
4℃离心 10min,取上清液冰上保存供测定 NADP+含量。
辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒使用说明
产品简介:
NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与
磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原
态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型
噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄
糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH,从而检测 NADP+含量。
二氧化碳(CO2)测定试剂盒(PEPC 酶法)说明书
二氧化碳(CO2)测定试剂盒(PEPC酶法)说明书【产品名称】二氧化碳(CO2)测定试剂盒(PEPC酶法)【包装规格】a)单一试剂:1×15mLb)单一试剂:2×40mLc)单一试剂:5×60mLd)单一试剂:2×100mL【预期用途】用于体外定量测定人血清中二氧化碳的含量。
血液中CO2含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。
增高:代谢性碱中毒,如幽门梗阻、柯兴综合征等。
呼吸性酸中毒,如呼吸中枢抑制、呼吸机麻痹等。
降低:代谢性酸中毒,如严重腹泻、肾功能衰竭等。
慢性呼吸碱中毒[1]。
临床上测定二氧化碳代谢性与呼吸性酸、碱中毒的辅助诊断,通常与pH值同时进行。
【检验原理】样本中的碳酸氢根在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化下,与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)反应,生成草酰乙酸和磷酸;草酰乙酸在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下,生成苹果酸,同时NADH被氧化成NAD+,NADH被氧化的程度与碳酸氢根的含量成正相关。
【主要组成成分】试剂主要组分三羟甲基氨基甲烷缓冲液250mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)10g/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)10KU/L苹果酸脱氢酶(MDH)8KU/L还原型辅酶I(NADH) 2.2g/L表面活性剂及稳定剂适量注:不同批号试剂盒中各组分未经试验不可互换。
【储存条件及有效期】1.试剂原包装在2~8℃储存,有效期为12个月,生产日期、有效期见标签。
2.开口后的试剂在仪器仓中(2~8℃)可稳定30天。
【适用仪器】艾威德AS-420/AS-660/AS-1200;日立HITACHI7020型/7060型/7180型/7600型/LABOSPECT008AS型;贝克曼AU400/AU480/AU640/AU680/ AU2700/AU5400/AU5800/AU5811/AU5821;佳能TBA-FX8/TBA-120FR/ TBA-2000FR;罗氏cobas8000c702/cobas8000c701/cobas8000c502;西门子SIEMENS ADVIA1800/ADVIA2400;雅培ABBOTT ARCHITECT c8000/ARCHITECT c16000/ARCHITECT ci8200;西森美康SYSMEX BM6010/C;科华KHB卓越310/卓越330/卓越400/卓越450/ZY-1200/ ZY-1280;迪瑞CS-240/CS-T300/CS-300B/CS-380/CS-400A/CS-400B/ CS-600A/CS-600B/CS-800A/CS-800B/CS-1200/CS-1200ISE/CS-1300B/CS-14 00;迈瑞MINDRAY BS-220/BS-330/BS-350E/BS-380/BS-390/BS-400/BS-430/ BS-600/BS-800/BS-2000M;颐兰贝ES-200/ES-380/ES-480;赛诺迈德SUNMATIK-9050型;雷杜Chemray420;英诺华D280;特康TC6010L;锦瑞GS400;普康6066。
碱性磷酸酶测定试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法)产品技术要求lepu
碱性磷酸酶测定试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法) 适用范围:用于体外定量测定人血清中碱性磷酸酶的活性.1.1 规格试剂1:1×60mL,试剂2:1×12mL;试剂1:1×60mL,试剂2:1×15mL;试剂1:1×60mL,试剂2:1×20mL;试剂1:4×60mL,试剂2:4×15mL;试剂1:2×40mL,试剂2:2×10mL;试剂1:1×4L,试剂2:1×1L;试剂1:2×4L,试剂2:1×2L。
1.2 主要组成成分试剂1主要组分:试剂2主要组分:2.1 净含量应不低于试剂瓶标示装量。
2.2 外观试剂1:无色或淡黄色透明溶液;试剂2:无色或微黄色溶液。
外包装完好、无破损,标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白2.3.1 试剂空白吸光度在405nm处测定试剂空白吸光度,应≤0.5;2.3.2 试剂空白吸光度变化率用生理盐水作为样品加入试剂测试时,试剂空白吸光度变化率(△A/min)应不大于0.005。
2.4 分析灵敏度测试120U/L碱性磷酸酶时,吸光度变化率(ΔA/min)应不低于0.0009。
2.5 准确度参照CLSI EP9-A2的方法,与比对试剂盒同时测试40例线性范围内的不同浓度的血清样本,其相关系数r2≥0.95。
每个浓度点在[25,100]U/L区间内绝对偏差不超过±10U/L;(100,750]U/L区间内相对偏差不超过±10%。
2.6 重复性用血清样品或质控样品重复测试所得结果的变异系数(CV)应不大于5%。
2.7 线性2.7.1在[25,750]U/L(37℃)区间内,线性相关系数r应不小于0.990;2.7.2 [25,100]U/L区间内绝对偏差不超过±10U/L;(100,750]U/L区间内相对偏差不超过±10%。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(PEP比色法)
Solution、NADH 工作液、ddH2O,恢复至室温,按 PEPC Assay buffer:PEP Solution: MDH Solution:NADH 工作液:ddH2O,混匀,即为 PEPC Assay buffer 工作液。 最好即配即用,预冷备用,保存 1 月有效。 4、 PEPC 加样:按照下表设置对照管(备选,一般可以不设对照管)、测定管,溶液应按照 顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性过高, 可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测最好能设置平行管。
北京雷根生物技术有限公司
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)检测试剂盒(PEP 比色法)
简介:
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是 C4 植物和 CAM 植物固定 CO2 的关键酶,为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈 不可逆反应的酶,在植物和细菌中广泛存在,在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。大肠杆菌中 的酶分子量约 36 万的四聚体,可受很多因素的影响,例如可为乙酰辅酶 A 活化,可受天 门冬氨酸抑制。此酶是变构酶,主要功能为供给三羧酸循环以草酰乙酸,另外也与 C4 植物 光合二氧化碳固定反应(C4 二羧酸循环)及景天科植物的苹果酸形成(景天酸代谢)等有关。
加入物质(ml) ddH2O 待测样品 PEPC Assay buffer 工作液
对照管(备选) 0.07 — 1.96
测定管 — 0.07 1.96
磷酸化试剂盒使用方法
磷酸化试剂盒使用方法
1. 组织总蛋白的提取:
- 在1ml的冷裂解液中各加入10ul的磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和PMSF混匀,放置在冰上备用;
- 称取0.1g的新鲜组织,放置于玻璃匀浆器的入口缓冲处,用眼科剪将组织块尽可能的剪碎,然后加入0.5-1ml 的新配置的裂解液,研磨直至没有明显的组织块,这个过程需注意冰上操作;
- 将组织匀浆液移入1.5ml的EP管中,4 ℃ 12000g 离心30min;
- 吸取上清至新的管中;
- 进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。
2. 细胞总蛋白的提取:
- 裂解液的用量:107个细胞需要裂解液1ml;
- 贴壁细胞:弃去培养基,用冷的PBS 洗两次,弃去PBS,然后加入计算好的细胞裂解液;在冰上用细胞刮刀进行刮离细胞,将刮离的细胞裂解液移入EP管中,颠倒裂解20-30min;
- 悬浮细胞:4℃ 400g 离心收集细胞,用冷的PBS洗两次细胞,同样按细胞数加入裂解液,涡旋10s,放置冰上裂解10min,重复3-4次;
- 裂解完毕之后,将细胞裂解液4℃ 12000g离心30min;
- 将上清移入新的EP管中;进行蛋白定量或者变性进行蛋白实验。
请注意,在使用磷酸化试剂盒时,务必仔细阅读相关说明书和安全注意事项,严格按照操作步骤进行,以确保实验结果的准确性和安全性。
如果你还有关于磷酸化试剂盒使用的其他问题,请咨询专业人士。
果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)试剂盒说明书
货号:MS3502 规格:100管/96样果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase,FBP)试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:果糖-1,6二磷酸酶又称果糖1,6二磷酸酯酶,催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和无机磷,在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。
测定原理:FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和无机磷,在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算FBP活性。
自备实验用品及仪器:分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:提取液一:液体100mL×1瓶,4℃保存。
提取液二:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入20mL试剂四充分溶解待用,用不完的试剂4℃保存;试剂二:液体7.2μL×1支,4℃保存;临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂4℃保存;试剂三:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂4℃保存;试剂四:液体25mL×1瓶,4℃保存;样本的前处理:①总FBP酶提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定。
②胞浆和叶绿体FBP酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一),冰浴匀浆后于4℃,200g离心5min,弃沉淀,取上清在4℃,8000g离心10min,取上清用于测定胞浆FBP酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定叶绿体中FBP酶活性。
V-ATP酶试剂盒说明书
植物V型ATP酶(V type ATPase)活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途植物V型ATP酶(V type ATPase)活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用V型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环反应系统,通过排除P型和F型ATP酶干扰的前提下,测定ATP水解产生的ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应,即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化,以此进行测算单位酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适合于各种植物组织,包括种子(seed)、叶片(leaf)、根(root)、胚胎叶(cotyledon)、上胚轴(epicotyl)等裂解悬液,以及内涵体、溶酶体、囊泡体、微粒体等V型ATP酶的特异活性检测。
产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
技术背景腺苷三磷酸酶,又称为ATP酶(adenosine triphosphatase;ATPase或ATP phosphohydrolase;EC3.6.1.3),属于磷酸水解酶,可以催化含磷的酸酐分解,即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。
ATP酶的去磷酸化反应释放出能量,成为细胞生命代谢的能源。
ATP酶为跨膜蛋白(transmembrane),帮助传输各种代谢分子进出细胞。
根据ATP酶的结构和功能,分为五类不同的ATP酶,即F、V、A、P和E型。
F型,又称为F1F0型,主要在线粒体、叶绿体或细菌细胞膜上,进行氧化磷酸化或光合作用;P型,又称为E1E2型,存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上,其功能在于水解ATP获得能量,跨膜运输各种化学分子,包括Ca2+传输性、Na+-K+/H+-K+传输性、H+传输性和所有细菌型等,其中胃氢/钾ATP酶,一种与胃酸分泌相关的质子泵,属于这一类型。
V型,又称为V1V0型,主要存在于真核细胞的液泡(vacuole)中。
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)酶联免疫分析试剂盒使用说明书
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
96T检测范围:0.8 U/ml-24 U/ml使用目的:本试剂盒用于测定植物组织,细胞及其它相关样本中植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性。
实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物苹果酸酶(malic enzyme)水平。
用纯化的植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase),再与HRP标记的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加入底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化为蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性浓度。
试剂盒组成:1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品(48U/ml) 0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1瓶12 密封袋1个标本要求1、标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
2、不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶(HRP)的活性。
操作步骤1、标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图标在小试管中进行稀释。
24U/ml 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液12U/ml 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液6U/ml 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液3U/ml 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液1.5U/ml 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2、加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。
植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒说明书
植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒说明书试验原理:植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。
先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。
洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。
内容及其配制自备材料1)蒸馏水。
2)加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3)振荡器及磁力搅拌器等。
安全性1)避免直接接触终止液和底物A、B。
一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2)实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3)不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
作注意事项1)试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
2)实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
3)不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4)使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
5)使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6)洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7)底物A应挥发,避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
避免用手接触,有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8)加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9)按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
样品收集、处理及保存方法1)血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。
使用不含热原和内毒素的试管。
收集血液后,1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2)血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。
1000×g离心30分钟去除颗粒。
一种生产磷酸丙糖异构酶的方法[发明专利]
专利名称:一种生产磷酸丙糖异构酶的方法
专利类型:发明专利
发明人:何国声,魏佳,徐梅倩,朱顺海,曹杰,赵其平,张大兵,梁婉琪,黄燕,严凤,高兴春,郭敏,黄侠,姚宝安
申请号:CN200510111214.7
申请日:20051207
公开号:CN1978637A
公开日:
20070613
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了一种生产磷酸丙糖异构酶的方法,包括以下步骤:(1)将磷酸丙糖异构酶的全长基因克隆入表达载体,将重组后的表达载体进行增殖;(2)酶切增殖后的表达载体,使其线性化,然后转化入毕赤酵母细胞中,利用毕赤酵母表达系统进行表达;(3)收集表达产物。
本发明还公开了毕赤酵母细胞的用途,用于作为表达系统来生产磷酸丙糖异构酶。
本发明的方法是一种低廉且产量高的表达磷酸丙糖异构酶的方法。
本发明中磷酸丙糖异构酶在毕赤酵母中的表达量可达1200mg/l,较原核表达系统高出数倍且易于纯化,便于投入实践应用中。
申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所
地址:200232 上海市徐汇区石龙路345弄3号
国籍:CN
代理机构:上海世贸专利代理有限责任公司
代理人:严新德
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磷酸丙糖异构酶作用机制
磷酸丙糖异构酶作用机制磷酸丙糖异构酶,这名字一听就让人有点晕,不是吗?你可能想,“天哪,这是什么神秘的东西,听起来好复杂。
”咱们今天就来揭开它的神秘面纱,带着点轻松幽默的态度,让你能明白它到底在做什么。
别急,咱们一步一步慢慢说。
磷酸丙糖异构酶,简而言之,它是一个酶。
啥是酶呢?嗯,就好比厨房里的厨师,专门做饭的。
酶在我们体内也差不多,就是帮忙加速各种化学反应的。
磷酸丙糖异构酶呢,专门负责一种叫“磷酸丙糖”的物质的转换。
听起来挺拗口,但别担心,我们不需要搞懂它的化学式,咱只要知道它做什么就行了。
它的工作就是帮磷酸丙糖从一个形态变成另一个形态,换句话说,它让磷酸丙糖变得“更好用”。
你可能会问,这磷酸丙糖到底是什么?好吧,其实它是一种在细胞里很常见的小分子,在我们体内的能量代谢中扮演着重要角色。
就像我们平时吃的饭菜,经过消化吸收后,转化成糖分,再转化成能量,磷酸丙糖就是这个过程中的一部分。
它可以被用来合成其他重要的物质,甚至能给我们提供能量。
所以说,磷酸丙糖就像是“能源工厂”里的原材料,而磷酸丙糖异构酶就像是那个会合理分配这些原材料的管理者。
现在来个小剧场:你想象一下,磷酸丙糖异构酶就像一个老练的经理,站在一个大工厂里,指挥着员工们将那些看似乱七八糟的原材料,按需求快速转换成各种不同的产品。
它不是直接生产能量,而是通过调整和转换磷酸丙糖的结构,让它变得可以在合适的时候发挥最大效益。
再想象一下,我们的细胞就像是一个大工厂,里面的每一台机器都在不停地运转,每一个酶都有它的职责,磷酸丙糖异构酶就是其中一个非常重要的小齿轮。
它帮助细胞处理那些重要的能量来源,让细胞得以维持生长、分裂和各种生理活动。
至于它的工作原理,不是那么复杂,听着可能有点小费劲,但只要知道一点:它的作用就是让磷酸丙糖的化学结构发生改变,从而让它能进入糖代谢的下一步。
说白了,它就像一个巧妙的“换位游戏玩家”,能让磷酸丙糖从一个角色切换到另一个角色,保证我们的细胞能顺畅地运转。
丙氨酸氨基转移酶试剂盒(丙氨酸底物法)
丙氨酸氨基转移酶试剂盒(丙氨酸底物法)标准化操作规程1 目的规范实验室操作, 保证检验工作顺利有效进行特制定此规程。
2 授权操作人经培训且考核通过的实验室检验人员。
3 适用范围: 本试剂适用于体外定量检测人血清或血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活力。
4 检验方法本试剂反应原理采用国际临床化学联合会(IFCC)推荐的方法。
5 检验原理在丙氨酸氨基转移酶的作用下, L-丙氨酸与α-酮戊二酸反应, 生成丙酮酸和L-谷氨酸。
丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶(LDH)还原为L-乳酸, 同时NADH被氧化为NAD+, 使340nm处的光吸收值下降, 通过监测340nm处光吸收值下降的速率, 可以测定丙氨酸氨基转移酶活力。
样品中内源性丙酮酸的干扰可由试剂中LDH在反应延迟时间内消除, 不会干扰测定。
ALTL-丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+L-谷氨酸LDH丙酮酸+NADH L-乳酸+NAD+6 检验标本要求6.1 样本为血清。
6.2 不得使用溶血或被污染的样本。
6.3 样本在2℃~8℃条件下可保存7天、室温条件下可保存1天。
7 试剂及配套品7.1试剂来源长春迪瑞医疗科技股份有限公司丙氨酸氨基转移酶试剂盒7.2试剂组成7.3试剂的稳定性与贮存:7.3.1 试剂在2℃~8℃条件下, 干燥、避光、密封贮存, 有效期为18个月。
7.3.2 试剂开封后在2℃~8℃条件下可稳定30天, 试剂不可冷冻。
7.3.3 反应液在2℃~8℃可稳定30天。
7.4试剂的变质指示: 若试剂混浊, 或在340 nm处试剂空白吸光度值低于1.000A 时, 不能使用。
8 实验仪器及性能指标8.1实验仪器迪瑞CS系列全自动生化分析仪8.2试剂性能指标8.2.1 空白吸光度: A≥1.000。
8.2.2 空白吸光度变化率: ︱△A︱/min≤0.002/min。
8.2.3 分析灵敏度:测试1U/L被测物时, 吸光度变化率(△A/min)<-0.0001。
hmp途径反应流程
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呼吸作用的代谢途径
丙酮酸的还原(去路)
乙醇发酵 COOH CH3 C O CHO CHOH CH3 CO2 CH3 起催化作用的酶分别是: 丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶 NADH2 NAD+
丙酮酸氧化放出二氧化碳。 TCA循环(三羧酸循环)
氧化磷酸化
底物水平磷酸化仅见于下列三个反应:
⑴ 3-磷酸甘油酸激酶 1,3-二磷酸甘油酸+ADP 3-磷酸甘油酸+ATP ⑵ 丙酮酸激酶 磷酸烯醇式丙酮酸+ADP 烯醇式丙酮酸+ATP ⑶ 琥珀酰硫激酶 琥珀酰CoA+H3PO4+GDP 琥珀酸+CoA+GTP
三磷酸鸟苷(GTP)参与蛋白质的合成
七、ATP的转换及利用
八、能荷(energy charge)
细胞中有许多酶的活力依赖于ATP/AMP或ATP/ADP浓度之比。在细胞中存在着ATP-ADP-AMP系统。此系统被称为腺苷酸库 可用能量载荷,简称能荷(energy charge)来表示。 [ATP]+1/2[ADP] [ATP]+[ADP]+[AMP]
-酮戊二酸脱氢酶系
该酶系包括三种不同的酶及六种辅助因子。 三种酶是-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰酰转移酶和二氢硫锌酸脱氢酶集成的复合体。 该酶系中的6种辅助因子是焦磷酸硫胺素(TPP)、CoA-SH、FAD、NAD+、硫辛酸和Mg2+。
三羧酸循环八步生化反应
第 五步 琥珀酰辅酶A在二磷酰鸟昔(GDP)和Pi参与下,生成琥珀酸和三磷酸鸟昔(GTP)。 催化的酶是:琥珀酰辅酶A合成酶
多酚氧化酶
抗坏血酸氧化酶
过氧化物酶与过氧化氢酶
乙醇酸氧化酶体系
(二)、呼吸链组分的排列顺序
植物可溶性糖含量试剂盒(分光光度法)使用说明
植物可溶性糖含量试剂盒(分光光度法)使用说明货号:BC0030规格:50T/48S产品简介:糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
检测原理为蒽酮比色法。
可用于可溶性单糖、寡糖和多糖的含量测定,具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。
试验中所需的仪器和试剂:可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、浓硫酸、研钵和蒸馏水。
产品内容:试剂一:粉剂×1瓶,4℃避光保存;试剂二:10ml×1瓶,4℃保存;操作步骤:一、样品中可溶性糖的提取:称取约0.1~0.2g样本,加入1ml蒸馏水研磨成匀浆,倒入有盖离心管中,沸水浴10 min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,8000g,常温离心10min,取上清液于10ml试管中,用蒸馏水定容至10ml,摇匀备用。
二、测定操作表:分光光度计预热30min以上,调节波长至620nm,蒸馏水调零。
调节水浴锅至95℃。
工作液的配制:在试剂一中加入5ml试剂二,充分溶解后使用,如较难溶解,可加热搅拌。
加样表(在EP管中反应):试剂(μl)空白管测定管样本200蒸馏水400200工作液100100浓硫酸10001000混匀,置95℃水浴中10min(盖紧,以防止水分散失),冷却至室温后,于620nm处,分别读取空白管和测定管吸光值,ΔA=A测定管-A空白管。
注意:空白管只要做一管。
如果ΔA大于1,需要将样本用蒸馏水稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数。
由于浓硫酸具有强腐蚀性,请谨慎操作。
可溶性糖含量计算:1、标准条件下测定的回归方程为y=8.55x-0.07;x为标准品浓度(mg/ml),y为吸光值。
2、按样本鲜重计算:可溶性糖(mg/g鲜重)=〔(ΔA+0.07)÷8.55×V1〕÷(W×V1÷V2)=1.17×(ΔA+0.07)÷W3、按样本蛋白浓度计算:可溶性糖(mg/mg prot)=〔(ΔA+0.07)÷8.55×V1〕÷(V1×Cpr)=0.117×(ΔA+0.07)÷CprV1:加入样本体积,0.2mL;V2:加入提取液体积,10mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本鲜重,g。
玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达
玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达马芳芳;苏彦冰;张彬;李红英;韩渊怀【摘要】为克隆玉米(Zea mays L .)磷酸丙糖异构酶基因 ZmT PI ,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米 T PI 基因的 cDNA 全长序列设计特异引物,以玉米叶片总 RNA 为模板,采用RT‐PCR 方法扩增得到了约750 bp 的基因编码区cDNA 片段,T /A 克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX‐4T‐1上,得到的重组表达质粒GST‐ZmTPI 转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。
结果显示,玉米 ZmT PI (GenBank :EU959275)cDNA 全长1216 bp ,753 bp 开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205 kDa ,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的 TIM 结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米 TPI 与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS‐PAGE 检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。
玉米 ZmTPI 蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。
%ZmT PI gene cloned from Zea mays was expressed in E .coli Bl21. In this work ,based on the full‐length cD‐NA sequences of maize T PI gene ,a cDNA coding region fragment about 750 bp was amplified using RT‐PCR method from total RNA of maize leaves and cloned into the prokaryotic expression vector PGEX ‐4T‐1 ,resulting the recombi‐nant plasmid of GST‐ZmTPI .The resulting construct GST‐ZmTPI was then transformed intoE .coli Bl21 for further analysis .Results showed that the ZmT PI (GenBank :EU959275) cDNA sequence is 1 216 bp in length and has an open reading frame (ORF) of 753 nucleotides ,encoding a protein of 250amino acids with a predicted molecular mass of approximately 26.7205 kDa polypeptide and an isoelectric point of 5.12 ;The ZmTPI protein has highly conserved TIM domain ,and was highly similar with its homologous proteins in other plants ;phylogenetic analysis showed that the de‐duced amino acid sequence of ZmTPI was most similar to that of Saccharum o f f icinarum ,indicating that they belong to the same evolutionarybranch ;SDS‐PAGE assay showed that the fusion protein was successfully expressed and puri‐fied with the expected size .The ZmT PI gene was cloned and successfully expressed and purified in E .coli Bl21. This study will provide a foundation for further research on biological function of this protein .【期刊名称】《山西农业大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2016(036)006【总页数】7页(P381-386,438)【关键词】玉米;磷酸丙糖异构酶;基因克隆;原核表达【作者】马芳芳;苏彦冰;张彬;李红英;韩渊怀【作者单位】山西农业大学农学院,山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西太原 030031;山西农业大学农学院,山西太谷030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西太原 030031;山西农业大学农学院,山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西太原 030031;山西农业大学农学院,山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西太原 030031;山西农业大学农学院,山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室,山西太原 030031【正文语种】中文【中图分类】S513;Q78磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)能够催化二羟丙酮磷酸(DHAP)和D型甘油醛-3-磷酸(GAP)这两种丙糖磷酸异构体之间的可逆转换[1,2],作为糖酵解及糖异生途径中的关键酶,TPI被发现几乎存在于所有的生物体当中[3,4]。
磷酸丙糖异构酶(TPI)活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4209
磷酸丙糖异构酶(TPI )活性检测试剂盒说明书注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:UPLC-MS-4209规格:100T/96S 产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员。
微量法试剂名称规格保存条件提取液一液体110mL×1瓶2-8℃保存提取液二液体110mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体13mL×1瓶2-8℃保存试剂二粉剂×2支-20℃保存试剂三粉剂×2支-20℃保存试剂四粉剂×2支-20℃保存溶液的配制:1、试剂二:临用前取1支加入1.1mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存4周,避免反复冻融;2、试剂三:临用前取1支加入1.1mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存4周,避免反复冻融;3、试剂四:提供一8mL 棕色空试剂瓶。
临用前取1支试剂四加入2.5mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存2周,避免反复冻融。
产品说明:植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin 循环的重要酶。
作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与NAD 在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH ,340nm 处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
Dihydroxyacetone PhosphateTriose-Phosphateisomerase Glyceraldehyde-3-Phosphate Glyceraldehyde-3-Phosphate DehydrogenaseGlyceraldehyde-3-Phosphate +NAD Glycerate 3-Phosphate +NADH (340nm )注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC2190规格:50T/48S产品内容:提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存;试剂二:液体5mL×1瓶,4℃保存;试剂三:液体5mL×1瓶,4℃保存;试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用前加入4mL双蒸水充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;试剂五:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用前加入4mL双蒸水充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;试剂六原液:液体150μL×1支,4℃保存;试剂六稀释液:液体10mL×1瓶,4℃保存;试剂七:粉剂×1瓶,-20℃保存,临用前加入5mL双蒸水;用不完的试剂可分装后-20℃保存,避免反复冻融;试剂六工作液的配制:将试剂六原液:试剂六稀释液=7.5μL:322.5μL稀释,用多少配多少。
产品说明:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC4.1.1.31)广泛存在于植物和微生物中,在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。
是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶,同时也是C4植物和CAM植物固定CO2的关键酶,对三羧酸循环的运转起重要调节作用。
PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和HPO42-,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm测定NADH减少速率,计算PEPC活性。
试验中所需的仪器和试剂:紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:一、粗酶液提取:组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心20min。
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植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶试剂盒使用说明
分光光度法注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC1990
规格:50管/48样
产品内容:
提取液一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
提取液二:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。
临用前加5mL蒸馏水充分溶解。
试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。
临用前加5mL蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。
临用前加5mL蒸馏水充分溶解。
产品说明:
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。
作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
自备仪器和用品:
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计、1mL石英比色皿。
操作步骤:
一、酶液提取
按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL 提取液一)加入提取液一,冰浴匀浆后于4℃,1000g离心5min,取上清在4℃,4500g离心20min,去上清,取沉淀加0.5mL提取液二,置于震荡仪上震荡30s溶解,置冰上30min,重复操作一次(或者震荡溶解后超声,超声条件为功率200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,12000g离心10min,取上清待测。
二、测定操作
1.分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2.取1mL石英比色皿,依次加入600μL试剂一,100μL试剂二,100μL试剂三,100
μL试剂四,100μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,△A=A2-A1
三、浓度计算:
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr (2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/g)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=160.77×ΔA÷W
V反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
注意事项:
配置好的试剂二、试剂三、试剂四3天内使用完。