结核分枝杆菌抗酸染色装置的研制
抗酸染色的操作及临床应用
抗酸染色的操作及临床应用抗酸染色是一种在临床病理学中常用的技术，用于检测和诊断与酸性染料亲和的微生物，特别是结核分枝杆菌。
这种染色方法被广泛应用于结核病的确诊、治疗监测及相关疾病的鉴别诊断。
下面将详细介绍抗酸染色的操作及临床应用。
操作方法：1. 原料准备：准备好益氏染液、酸酒红溶液、高锰酸钾溶液、酸性酮液、甲苯、绝对醇和脱脂溶剂等试剂和溶液。
2. 标本制备：将待检标本如痰液、尿液、刮片等经过前处理（如离心、加热、电洗等）后涂片制备，并将涂片固定在90摄氏度的焙烧烘箱中固定片上3~5秒钟，然后用冷水洗净。
3. 染色操作：将固定的检测标本涂片用甲苯浸泡2~5分钟，将甲苯吸出后加入酒精脱脂2~5分钟，然后再用绝对醇脱脂2~5分钟，最后用脱脂溶剂脱脂30~120秒。
4. 抗酸染色：将脱脂后的标本涂片完全浸入益氏染液中，保持液面在标本上1~2毫米高，将益氏染液再加热到80摄氏度，静置5~10分钟，待酸性酮为蓝色。
5. 染色反应：用高锰酸钾溶液滴落在标本上，加热到细菌虫红颜色被去掉，再滴落高锰酸钾溶液热到细菌虫红显现为红色。
6. 清洗与固定：倾倒掉多余的染色剂和高锰酸钾溶液，用自来水彻底冲洗，将标本涂片风干或用吹风机吹干。
7. 反染：将涂片溶于酸酒红溶液中，温和地与酸酒红反应。
反应结束后，再次用自来水冲洗，风干，镜片上缀油。
临床应用：1. 结核菌检测：抗酸染色是诊断结核病的重要手段之一。
通过检测患者痰液、刮片等标本中的抗酸染色-阳性颗粒，可以快速、敏感、直观地进行结核分枝杆菌的检测和诊断。
2. 结核病确诊：抗酸染色技术作为结核病的初筛方法，可帮助医生进行早期诊断和治疗。
对于疑似结核病患者，通过抗酸染色检测可快速识别结核菌，指导早期治疗方案的制定。
3. 结核病治疗监测：抗酸染色技术可用于结核病治疗效果的评价和疗程的调整。
治疗过程中，定期检测患者的痰液标本，观察结核菌的存在和培养基的数量，以判断治疗效果并及时调整治疗策略。
抗酸染色架的制作和使用
外。 其余 的玻 片凹 陷处 全部切 除（ 凹陷 的片与片之 间以及 但
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文章编号 １０ — ０ ３２ ０ ） 一 ５ １ Ｏ ０ ８ ０ ２ （０６０ ｏ ８ — １ ６
后 用手 移动 点 燃 的酒 精 灯 按 顺 序 逐 一 固 定 ．一 般 ５８ 内将 火 焰 烘烤 玻 片 来 回 ４次 ，火 焰 与 玻 片 的 距 离 保 持 在 ｌｍ 以上 。 ｃ 若 火 焰 与 玻 片 的 距 离 明 显 不 到 ｌｍ． 体 可 由 温 度 的 升 高 而 ｅ 菌
取 医院病理科 常用的 能耐温的 铝制或其 它金 属材料 做 成的 双排凉 片板一块 （ 排能放 置 １ 每 Ｏ张玻 片 ．两排 共 ２ ０
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的使 用 ， 收到 了 明 显 的 效 果 。 同时 也 极 大 地 减 轻 了 劳 动 强 度 。
加 热 至 出 现 蒸 气 后 ， 离 火 焰 ． 后 一 张 玻 片 加 热 并 保 持 脱 最
５ ｉ 倾 斜染 色 架用 流 水 逐 一 轻 缓 冲 去染 色 液 ． 去 标本 上 ｍ ｎ后 沥 剩余的水 ． 可用电吹风吹干。 也
Ziehl-Neelsen抗酸杆菌染色法
Ziehl-Neelsen抗酸杆菌染色法抗酸杆菌Ziehl-Neelsen染色法(AFB) 用途:用于证实抗酸杆菌引起结核病的分支杆菌属。
原理:结核菌的抗酸染色性与菌体表面索状结构内所含肽糖脂的分枝酸残基(Arylmethanemycolate)和胞壁固有层的完整性有关。
碱性复红同分枝残基酸牢固结合形成复红-分枝酸复合物，用盐酸酒精漂洗褪色时，能够抵抗稀酸的漂洗，难以将染料从复合物中再溶解而渗入菌体。
细菌的荚膜分子量很高以至于在室温呈蜡状，而且细菌的荚膜能够防止水系碱染液(革蓝氏)染液的渗透。
对照:含有抗酸菌的组织，染色过程中使用微孔过滤水漂洗。
固定:10%甲醛。
切片:石蜡切片4-5微米。
用品:所有玻璃器皿用双蒸水冲洗，立式染色缸，微波炉。
试剂:Ziehl-Neelsen酚品红液:液体:碱性复红 2.5g蒸馏水 250ml无水乙醇 10ml石炭酸(被溶化)12.5ml充分混合后过滤于棕色瓶内，标明原始日期，液体稳定性1年。
注意:致癌剂，有毒。
1%酸酒精:盐酸 10ml70%乙醇 990ml充分混合，标明原始日期，液体稳定性1年。
注意:有腐蚀性。
甲基蓝贮存液:美兰(甲基蓝) 0.7g蒸馏水 50ml充分混合后，过滤于瓶中，标明配制日期，稳定性1年。
甲基蓝工作液:甲基蓝贮存液 5ml蒸馏水 45ml倒入立式染色缸，稳定性两个月。
注意:避免接触与吸收。
安全措施:戴手套和防护镜，穿工作衣。
防热打，开盖子，液体在通风柜内排尽避免接触与吸收。
碱性复红:致癌剂石炭酸:通过消化道和皮肤吸收中毒，通过皮肤吸收迅速，引起心率加快，痉挛而死亡。
会烧伤皮肤和眼睛，止痛作用使疼痛消失。
作用的目标器官消化、神经和泌尿系统。
盐酸:对皮肤、眼睛和呼吸道有强烈的刺激。
作用目标器官通过皮肤呼吸道生殖和胎儿系统吸收。
甲基蓝:对老鼠的生殖力产生有害的作用。
抗酸杆菌Ziehl-Neelsen染色法(AFB)步骤1( 脱蜡至蒸馏水。
2( 酚品红液微波炉80power，45秒，切片在热染液中维持5mins。
结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤
结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤结核分枝杆菌是引起结核病的病原体之一，因其具有较强的传染性和致病性，早期准确、快速地检测结核分枝杆菌对于结核病的防控具有重要意义。
为了满足临床检测需求，研发结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒是非常必要的。
下面是研发结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒的一般步骤：1.确定检测指标：首先需要确定要检测的结核分枝杆菌的特异性指标，常用的指标包括结核分枝杆菌特异性区域的基因片段、结核分枝杆菌特异性抗原等。
根据已有的研究结果和实际需求，选择一个或多个特异性指标作为荧光定量检测试剂盒的靶点。
2.设计引物和探针：根据选定的靶点，设计特异性的引物和探针。
引物和探针的设计需要考虑其与目标序列的亲和力和特异性，同时需要避免与其他相关菌株的DNA序列发生杂交。
3.合成引物和探针：根据设计的引物和探针序列，通过化学合成的方式合成引物和探针。
合成的引物和探针需要经过质量检测，确保其纯度和特异性。
4.设计PCR反应体系：根据引物和探针的特点，设计PCR反应的体系，包括反应缓冲液的配制、核酸模板的添加量、引物和探针的浓度等。
优化PCR反应条件，确保其在荧光定量检测的条件下具有高灵敏度和特异性。
5.建立荧光定量PCR方法：使用设计的引物和探针以及优化的PCR反应体系，进行一系列实验优化步骤，包括PCR温度和时间条件的优化，反应体积的优化，引物和探针的最佳浓度等。
通过不断的试验验证，建立一个可重复、准确、灵敏的荧光定量PCR方法。
6.确定标准曲线和阈值：通过使用已知浓度的结核分枝杆菌标准品，进行一系列PCR反应，并测量荧光信号强度。
根据PCR反应体系中添加的结核分枝杆菌标准品的浓度和相应的荧光信号强度，绘制标准曲线。
根据标准曲线的斜率和y-截距，确定荧光信号阈值，用于定量测定未知样品中的结核分枝杆菌浓度。
7.优化试剂盒成分：根据已建立的荧光定量PCR方法，进一步优化试剂盒的成分，包括引物和探针的最佳浓度、反应缓冲液的配制等。
结核染色方法 -回复
结核染色方法-回复"结核染色方法"是一种用于检测结核病的实验室技术。
结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，早期诊断和治疗对于控制疾病的传播非常重要。
在这篇文章中，我们将一步一步回答结核染色方法的相关问题。
第一步：准备标本在进行结核染色之前，我们需要准备一份标本样本。
结核病常见的标本来源包括痰液、浸润组织、活检组织等。
其中，痰液是最常用的标本样本，因为结核分枝杆菌存在于患者的呼吸道中。
为了得到高质量的标本，患者应被指导正确地咳嗽或咳痰以采集标本。
第二步：制备涂片获得标本后，我们需要将其制备成涂片。
涂片制备是结核染色方法的关键步骤之一，其目的是将标本均匀地涂布在载玻片上。
首先，我们取一小滴标本样本，将其放置在玻片上，并使用另一个玻片将其均匀涂布于全玻片的一侧。
然后，我们小心地将两片玻片夹紧，使标本在两片玻片之间均匀分布。
完成涂片制备后，我们需要在其表面写上标本来源和编号，以便后续操作。
第三步：热固定在进行结核染色之前，涂片需要经过热固定处理。
热固定是一种将细菌固定于载玻片上的方法，有助于保持其形态结构。
涂片首先需要被置于热盒中，通常在56摄氏度下加热30分钟。
这一步骤有助于杀死细菌并使其附着在载玻片上。
第四步：染色进行染色是检测结核病的关键步骤。
常用的结核染色方法包括抗酸染色法和荧光染色法。
4.1 抗酸染色法：抗酸染色法是最常用的结核染色方法之一。
其原理是使用一个强酸性染料（通常为红色），将细菌细胞壁中的脂质染成红色。
这种方法简单、经济实用，并且易于观察。
4.2 荧光染色法：荧光染色法是一种使用荧光剂来标记细菌的方法。
这种方法借助荧光染料的特异性，使结核菌在显微镜下呈亮绿色发光。
荧光染色法的优点是其敏感性高、特异性强，能够提供更快速和准确的诊断结果。
第五步：观察和解读在染色完成后，我们需要使用显微镜观察和解读涂片的结果。
结核分枝杆菌在显微镜下通常呈现为红色（抗酸染色法）或亮绿色（荧光染色法）的细胞。
《医学微生物学》抗酸染色与墨汁负染色方法实验
《医学微生物学》抗酸染色与墨汁负染色方法实验[目的]1．掌握结核分枝杆菌形态、染色特点。
2．掌握新生隐球菌的形态特点。
3．掌握抗酸染色法。
4．掌握墨汁负染色法。
[内容]1．结核病人痰液的检查。
2．墨汁负染色法。
一、结核分枝杆菌抗酸染色结核病人痰液的检查[抗酸染色原理]分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，特别是其中大量分枝菌酸可影响染料穿入。
石炭酸复红染色加加速剂染色后可以染上，着色后不易被盐酸酒精脱色。
[材料]结核病人的痰液标本、抗酸染色液、木夹、显微镜等。
[方法]1．涂片制备用无菌棉签挑取结核病人痰液标本中的脓性或干酪样部分，在载玻片均匀涂抹成2×2cm大小的卵圆形痰膜；也可待干燥后再涂一层，制成厚膜涂片。
自然干燥，火焰固定，于涂片外周用蜡笔画圈。
2．抗酸染色法（1）初染：用木夹夹住玻片的一端，滴加石炭酸复红染液和加速剂数滴，维持1分钟后水洗，甩干。
（2）脱色：用3%盐酸酒精脱色，至无红色染液流下为止，水洗，甩干。
（3）复染用碱性美兰染色1分钟，水洗。
自然或用吸水纸吸干。
（4）油镜检查。
[结果]结果观察与报告方式：1)抗酸染色标本镜检：在淡蓝色背景下可见染成红色的细长或略带弯曲的杆菌，并有分枝生长趋向，为抗酸染色阳性菌(图6-1)。
其他细菌和细胞呈蓝色。
直接涂片标本中常见菌体单独存在，偶见团聚成堆者。
若在痰、脑脊液或胸、腹水中找到抗酸菌，其诊断意义较大。
显微镜物镜(100×)所见结果按下列标准报告：仔细观察300视野(观察时间不少于4min)，未发现抗酸杆菌。
士：可疑。
发现抗酸菌l～2条／300视野。
1+：发现抗酸菌3～9条／100视野。
2+：发现抗酸菌1～9条／10视野。
3+：发现抗酸菌1～9条／每视野。
4+：发现抗酸菌≥10条／每视野。
以上报告方式只适于直接涂片，对集菌法涂片应按“发现抗酸菌”或“未发现抗酸菌”报告。
图6-1 结核分枝杆菌抗酸染色二、新生隐球菌墨汁负染色法[器材和试剂]1．菌种新生隐球菌。
结核分枝杆菌的抗酸染色原理
结核分枝杆菌的抗酸染色原理
结核分枝杆菌是一种革兰氏阳性杆菌，可以通过抗酸染色方法进行检测。
抗酸染色是一种特殊的染色方法，主要用于检测酸性杆菌，如结核分枝杆菌、炭疽杆菌等。
抗酸染色的原理是利用染色剂（如石蜡油、丙酮、苏木精、乙醇等）使细胞壁的脂质层变性，从而使细胞内的染色体暴露出来。
然后，在酸性条件下使用胶体染料如苏木精、甲基蓝和石蕊红等，这些胶体染料能够与细胞内的染色体结合，使其呈现出红色或蓝色。
对于结核分枝杆菌来说，由于其细胞壁中含有非常高比例的脂质，因此在抗酸染色中会呈现出红色或者粉红色，而其他细菌则会呈现出不同的颜色。
这种抗酸染色法可以快速准确地检测结核分枝杆菌的存在，是结核病的诊断标准。
需要注意的是，抗酸染色并不是100%准确的，因为有些非结核分枝杆菌也可以呈现出抗酸染色阳性。
因此，在临床上需要配合其他检测方法，如培养和PCR 等，以确定结核分枝杆菌的存在。
抗酸染色教学标本改良制备方法
抗酸染色教学标本改良制备方法摘要：目的提供一种安全、简单、易于制作的标本制备方法。
方法在液体培养基中加入吐温-80破坏分枝杆菌的索状因子，使其在培养基中形成分散浑浊生长，经高压灭菌后加入背景成分。
结果细菌含量比临床标本多，细菌形态、排列与临床标本无差异，背景效果好。
结论该方法安全、简单、易于制作，教学效果较好。
关键词：抗酸染色；教学；标本制备抗酸杆菌由于细胞壁含有大量脂类，能够抵抗盐酸酒精的脱色，存在不易着色和脱色的特点[ 1]。
所采用常规的苏木素 - 曙红染色无法把细菌明显鉴别出来。
目前，抗酸染色作为微生物学一种特殊鉴别染色方法，大量用于医学生的微生物学实验教学和临床诊断，虽然对临床诊断有所提高，但该法既不易完全脱色，而且操作繁琐费时。
本文介绍一种实用、安全的标本制作方法供实验教学和临床诊断参考。
1 材料酸性液体培养基参照文献[2]，吐温-80（重庆川江化学试剂厂），抗酸染色液参照文献[2]自行配制，卡介苗来源于疾控中心，分支杆菌菌种为生产卡介苗用的牛型结核分枝杆菌94001。
2 方法2.1参照文献[2]制备酸性液体培养基，三角烧瓶装，每瓶100毫升；另用酸性液体培养基90毫升，加入10毫升吐温-80混合（也可分开包装高压灭菌后再加入培养基混合）；包扎后高压灭菌。
有吐温-80和没有吐温-80的酸性液体培养基各取一瓶，分别接种结核分枝杆菌94001；一周后可见无吐温-80一瓶为生长形成较厚菌膜，加入吐温-80的培养基为浑浊生长，取出后高压灭菌。
2.2将菌膜生长的结核分枝杆菌倒入碾钵中加入石英砂进行碾磨，连续碾磨12小时为标本Ⅰ；同时另用一个碾钵中放入用于预防接种的卡介苗10支，也加入石英砂同样碾磨，连续碾磨12小时为标本Ⅱ。
在经高压灭菌的浑浊生长的结合分支杆菌中加入蛋清20毫升，用玻璃棒涤打混匀为标本Ⅲ；再到附属医院检验科经浓缩法检查的抗酸染色阳性痰标本为标本Ⅳ。
2.3上述标本经抗酸染色参照文献[2]，显微镜检查。
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均匀 ， 影响染色效果 ；２ 该方法加热时间以蒸气 冒 （） 出为判 断标 准 ， 不易 控 制 ；（ ） ３ 在染 色 实验 过 程 中 ， 染 液容 易溢 出及 干涸 ， 重 影 响染 色 的效 果 ； ４ 染 严 （） 色在 开放环 境 中进行 ， 围环 境 易被结 核 杆菌 污染 ， 周 影 响效 果 。本文 旨在 克 服 上 述 缺点 ， 制 一种 用 于 研 结 核杆 菌抗 酸染 色 的专 用仪器 ， 到稳 定染 色条 件 、 达 提 高染 色效 果 以及减 少 环境 污染 的 目的 。
结 核杆 菌 经 典 染 色 方 法 是 妻 一 氏染 色 法 … ， 尼 该 方 法在 开放 环境 中进 行 ， 点 如 下 ： １ 该 方 法采 缺 （） 用 酒精 灯火 焰加 热 ， 加热 温度 不 易控 制 ， 本受 热不 标
防止结 核杆 菌对 周 围环境 的污染 。
２ 装置 制备
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ＣＮ１ 一ｌ ５ ／Ｎ ２ ３２
实
验
室
科
学
第ｌ ３卷
第 ６期
２１ ００年 １Ｅ
Ｖｏ ． ３ Ｎｏ ６ １１ ． Ｄｅ ． ０１ ｃ２ ０
结核分枝杆 菌抗酸染色装置 的研制
张 维 ，沈况敏 ，汤思萍 ，李开腾 ，邹海军 ，金 梦琪 ，朱 萍
Ａｂｓｒ ｃ Ｔｏ ｉ ｒ ｖ ｈｅｄ ｓ ｄ ａ ｔｇ ｆｃ ｎ ｅ ｔ ｎ ｌａ ｉ —ｆｓ ｔｉ ｔ ｏ ｆｍｙ ｏ ａ ｔｒｕ ｔ ｂ ｒｕ— ｔ ａ ｔ： ｍｐ ｏ ｅｔ ｉａ ｖ ｎａ ｅ ｏ ｏ ｖ ｎ ｉ ａ ｃ ｄ ａ ｔｓａｎ ｍｅｈ ｄ ｏ ｃ ｂ ｃｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ｃ ｏ ｌｓｓ ｈ ｕ ｈ ｒ ｅ ｅ ｏ ｅ ｄ ｖ ｃ ｆａ ｉ ｆ ｓ ｔｉ ｏ ｉ ，ｔ ｅ ａ ｔ ｏ ｓｄ ｖ ｌｐ ａ ｎ ｗ ｅ ｉｅ ｏ ｃｄ－ ａ ｔｓａｎ．Ｔｈ ｅ ｉｎ，ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ，ｆ ｎ ｔｏ ｓ ａ ｄ ａ ｐ ｉ ｅ ｄ ｓｇ ｒｄ ｃｎ ｕ ｃｉｎ ｎ ｐ ｌ－ ｃ ｔ ｎ ｏ ｈ ｎ ｔｕ ｎ ｒ ｉ ｌ ｌｕ ｔａｅ ａ ｉ ｆｔ ｅ ｉ ｓｒ ｍｅ ｔａ ｅ ｍａｎ ｙ ｉｌ ｓｒ ｔｄ．Ｔｈ ｓｉ ｓｒ ｍｅ ｔｉ ｔｂ ｅ，ｅ ｓ －ｃ ｎ ｒ ｌａ ｄ ｏ ｅ ａｉ ｎ ｏ ｉ ｎ ｔｕ ｎ ｓｓａ ｌ ａ ｙ ｏ ｔｏ ｎ ｐ ｒｔｏ ． Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ： ｃ ｄ ａ ｔｓａ ｎ；ｍｙ ｏ ａ ｔｒｕ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ａ ｉ —ｆ ｓ ｔ ｉ ｃ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ｃ ｌ ｓｓ；ｔｍｐ ｒｔ ｅ ｃ ｎ ｒ ｌ ｅ ｅ ａｕｒ ｏ ｔｏ
（ ．湖 州师 范学 院 医学院 ；２ １ ．湖 州 师 范学院 息工程 学院 ，浙 江 湖州 ３ ３ ０ ） 信 １０ ０
摘 要 ：为了改进结核杆菌传统抗 酸染色方法的缺点 ，该文研 制一 种用 于结核杆 菌抗 酸染色 的装置 ，对 该装
置的设计 、制备 、功能及应用方法进行详 细的介绍 ，具有稳定 ，易控制 ，操作简便等优 点。
置 内的细 菌对 染色 过程 产生 影 响 。凹槽式 托 盘放 于 侧 面 ， 约距 箱 底 ２０ｎ ， 大 ０ ｍ 材料 为 不 锈 钢 ， 可 防 ｌ 既
结 核杆 菌抗 酸 染 色 装 置 结 构 图 见 图 １ 主 要 由 ， 箱体 和控 制装 置 组成 。箱 体外 形 尺寸 ３０ ２０ ３ ０ ０ ￣ ０ ￣ ２ ｍ （ × 高 ） 由 凹槽 式 托 盘 、 热 管 、 ｍ 长 宽Ｘ ， 加 传感 器 、 紫
外灯 、 放水 装 置 等组 成 。控 制 装 置用 于调 节 温 度 和 时 间 ， 形尺 寸 １ ０ １０ ２ ０ｍ （ 宽 × ） 外 ５ ｘ ０ ｘ ０ ｍ 长× 高 。 ２ １ 箱 体 ．
关键 词 ：抗 酸染色 ；结核杆菌 ；温度控制
中 图 分 类 号 ： ３ ８９ Ｒ ７ ．１ 文献标识码 ： Ａ ｄｉ１ ．９ ９ ｊｉ ｎ １７ － ３ ５ ２ １ ．６ ０ ２ ｏ：０ ３ ６／．ｓ ．６ ２ ４ ０ ．０ ０ ０ ． ５ ｓ
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ａ ｄ ｄ ｖ ｌ ｐ ｎ ｎ ａ ｉ －ｆ ｓ ｔ ｉ ｅ ｉｅ ｓ ａ ｃ ｎ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔｏ ｃ ｄ ａ ｔｓａ ｎ ｄ ｖ ｃ
该部 分 是 装 置 的 主体 部 分 ， 形 根 据 实 际需要 外 设 计 。箱 体采 用 了隔热 装 置 ， 内层 由不锈 钢 焊成 ， 外 层 由钢板 焊 接 而 成 ， 间填 充 石 棉 网 ， 热 层 厚 度 中 隔 ２ ｍ， 以充 分确 保保 温 隔 热 的效 果 。为 了实 验操 ２ｍ 可 作 及 更换 方便 ， 箱顶 上安 置紫 外灯 ， 在 此外 也 可达 到 全 面 杀菌 的效 果 ， 装 置 内部处 于无 菌环 境 ， 使 避免装