重组人粒细胞刺激因子在《中国药典》和《欧洲药典》中质量标准不同点的对比分析
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重组人粒细胞刺激因子在《中国药典》和《欧洲药典》中质量
标准不同点的对比分析
赵先亮;王春雨
【摘要】目的对比重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF,Filgrastim)在<中国药
典>(2005年版)和<欧洲药典>(6.3版)中标准的不同点,为国内研发机构对基因重组蛋白产品的研发及国内企业对该产品的进出口提供参考.方法按两部药典要求,对国产产品实样进行部分关键指标的检测分析.结果两部药典对该产品的标准描述上存在具体内容的区别.结论 :在现代药物的研发和生产中,对药品的国际及国内标准要进行综合分析而拟定.
【期刊名称】《药学研究》
【年(卷),期】2010(029)001
【总页数】3页(P25-27)
【关键词】重组人粒细胞刺激因子;重组人粒细胞刺激因子;欧洲药典;中国药典【作者】赵先亮;王春雨
【作者单位】山东科兴生物制品有限公司,山东济南250200;山东科兴生物制品有限公司,山东济南250200
【正文语种】中文
【中图分类】R921
生物技术药品的质量标准和检测方法的研究水平不仅影响着生物技术新药开发的进程,而且决定着生物技术药品产业的质量水平,是药品进入国际市场的一道大关。
从
广义上讲,基因重组蛋白药物是生物技术药物的一种。
随着生物技术的飞速发展,尤
其是国际市场部分基因重组蛋白药物专利逐个到期,其流通市场的数倍放大,如何制
定一个既遵守国内标准又符合国际市场需求的基因重组蛋白药物质量标准,值得大
家探讨。
我们以《欧洲药典》(第6.3版)(European Pharmacopoeia 6.3)[1]和《中国药典》2005年版(三部)[2]中共有的重组人粒细胞刺激因子(Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor,rhG-CSF,Filgrastim)为例,对该产品的部分质量标准不同点进行了对比分析,提出了自己的观点,以便对国内企业该
产品或类似产品的研发、进出口有所裨益。
1 材料与方法
1.1 蛋白含量测定液相色谱法(《欧洲药典》[1]),使用高效液相色谱仪(PE公司),C18反相色谱柱(150×4.6mm,S-3μm 20nm)。
Lowrry法[3](《中国药典》),
使用蛋白核酸分析仪(BECKM AN DU 640),Folin酚试剂(北京鼎国)。
1.2 HPLC纯度及相关蛋白 HPLC纯度为《中国药典》规定的高效液相色谱法[2],
相关蛋白均为《欧洲药典》规定的高效液相色谱法[1],均使用高效液相色谱仪(PE
公司),C18反相色谱柱(150×4.6mm,S-3μm 20nm)。
1.3 与rhG-CSF带电荷不同的杂质等电聚焦法[1](《欧洲药典》),用北京六一仪器厂生产的电泳仪,电泳温度为5~10℃,G-250染色。
2 样品
样品来自山东科兴生物制品有限公司提供的rhG-CSF原液及rhG-CSF纯化中间体。
对照品为《欧洲药典》规定的 Filgrastim CRS(rhG-CSF化学参考标准品,来自EDQM)。
3 结果
3.1 蛋白含量测定对相同样品分别使用两种方法进行测定,结果一致(见表1)。
表1 12个rhG-CSF样品的两种蛋白含量测定方法结果对比样品号 Low rry法(mg◦L-1)[方法 1]液相色谱法(mg◦L-1)[方法2] [方法2]/[方法 1]13.30 3.16
0.9623.09 2.89 0.9432.54 2.62 1.0342.76 2.93 1.0652.90 3.08 1.0662.29 2.38
1.047
2.07 2.19 1.0682.85 2.96 1.049
3.06 3.20 1.0510 2.95 3.07 1.0411 2.41
2.30 0.9512 2.87 2.89 1.01平均值 1.02
3.2 HPLC纯度及相关蛋白《中国药典》对 rhG-CSF HPLC纯度的测定方法中,对洗脱时间及流速没有具体规定,我们使用流速1.0mL◦min-1,乙腈浓度自0%~70%梯度洗脱45min,rhG-CSF原液检测纯度为100%。
根据《欧洲药典》规定相关蛋白测定方法对同一样品进行测定,rhG-CSF纯度为98%。
经对rhG-CSF纯化中间体进行两种方法的测定,发现《欧洲药典》规定相关蛋白测定方法分离出了更多的杂质峰(见图1 D)。
图1 HPLC色谱图
3.3 与rhG-CSF带电荷不同的杂质检测结果表明,电泳图谱中rhG-CSF原液的主条带pI值为6.2左右,与Filgrastim CRS的主条带位置一致,无超过10倍稀释的Filgrastim CRS样品所得主要条带(10%)深度的其它条带(见图2)。
图2 等电聚焦图谱
4 讨论
在《欧洲药典》中,rhG-CSF标准是以原料药的形式给予表述的,在《中国药典》中是在“各论”的“重组人粒细胞刺激因子注射液”中以原液的形式予以描述,两者所述物质相同,但是标准却有一定差异(见表2)。
表2 《中国药典》和《欧洲药典》对rhG-CSF标准规定的不同点检测指标《中国
药典》标准《欧洲药典》标准蛋白质含量 Low ry法液相色谱法纯度或杂质测定rhG-CSF纯度不低于95.0%(非还原SDS-PAGE电泳法)比rhG-CSF分子量高或低的杂质不超过2.0%(还原及非还原条件下SDS-PAGE电泳法)rhG-CSF主峰不低于95.0%(反相HPLC法) 每一个杂质不超过 2.0%,杂质总计不超过 3.5%(反相HPLC 法)未规定此检测标准与rhG-CSF带电荷不同的杂质不超过10%(等电聚焦法)未
规定此检测手段分子量高于rhG-CSF的杂质不高于2%(尺寸排阻色谱法)。
分子
量18.8kD±1.88 kD(还原SDS-PAGE电泳法) 未规定此检测手段残余抗生素活性
不含氨苄西林或其它抗生素活性(抗生素残留量检测法) 未规定此检测手段细菌内毒素小于10EU/300μg蛋白(1EU=1IU) 小于2IU/1mg蛋白等电点主区带应为
5.8~
6.6(等电聚焦法) 主区带应为5.7~6.3(等电聚焦法)紫外光谱扫描最大吸收峰波长应为278±3nm 未规定此检测手段N末端氨基酸序列 Thr-Pro-Leu-Gly-
Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu 未规定此检测手段
综合以上不同之处,可以分为3类:一是具有不同的检测指标;二是相同的检测指标标准不同;三是同一指标因不同的检测方法而控制的内容不同。
4.1 不同的检测指标《中国药典》中强化对引入杂质-抗生素的控制,有抗生素残留量检测项目,进一步保证了最终产品的安全性。
对rhG-CSF的鉴别项目包括:紫外光谱扫描、肽图、N末端氨基酸序列,《欧洲药典》并未收载紫外光谱扫描及N末端氨基酸序列这两个检测项目,而是在四种杂质检测项目中均规定了与Filgrastim CRS进行比对,以进行鉴别,鉴别手段精确可靠。
《欧洲药典》强化了对rhG-CSF
纯度的控制,详细描述了四种对杂质含量的检测方法及标准,而《中国药典》仅规定
有两种方法,且标准较低。
4.2 相同的检测指标标准不同《欧洲药典》规定比rhGCSF分子量高或低的杂质
不超过2.0%,而《中国药典》对应项目测定中规定纯度不低于95.0%,《中国药典》对此杂质的控制标准较松,与此对应,比活性的控制标准也较低为“每毫克蛋白不低
于6.0×107IU”,低于《欧洲药典》的规定:“每毫克蛋白质不低于1.0×108IU”。
4.3 同一指标因不同的检测方法而控制的内容不同《中国药典》规定的“HPLC法纯度”测定项目及《欧洲药典》规定的“相关蛋白”测定项目,均是测定rhG-CSF
原液纯度或杂质的,使用反相HPLC法,但是规定的具体实验方法不同。
《欧洲药典》规定的“相关蛋白”测定法,能够将与rhG-CSF物理结构及性质极为相似的相关蛋白(Related proteins)检测出来,这些相关蛋白包括两种rhG-CSF氧化物(图1 D中峰1、峰2)、rhG-CSF甲酰化物(图 1 D中峰 3)、未完全复性的rhG-CSF蛋白(图1 D中峰4)等。
而按《中国药典》规定的HPLC法进行测定,难以将这些疏水性与rhG-CSF极为相似的相关蛋白检出,因而无法对其进行控制。
《欧洲药典》规定的蛋白含量使用相关蛋白测定项中描述的液相色谱法,使用Filgrastim CRS做标准进行计算得出,其结果为rhG-CSF蛋白的含量,而中国没有rhG-CSF同质标准品,《中国药典》规定使用蛋白标准品(人血白蛋白),以lowry法
测定rhG-CSF原液中总蛋白含量。
虽然这两种方法使用的标准品无法进行蛋白含
量的同一量值溯源,但经过对高纯rhG-CSF原液蛋白含量测定对比,两者结果基本一致。
产品质量标准必须依据其生产工艺,依据其过程控制及质量保证手段及能力,乃至于
依据国情而制定,rhG-CSF作为生物仿制药在中国快速上市,研制过程中对生产工艺、过程控制和临床前研究等方面,距离欧美的标准还有一定差距,对产品的质量控制有
基于国内具体情况的考虑,这是导致两部药典规定的检测指标不一致的主要原因。
由以上研究可见,在基因重组蛋白药品国际市场竞争异常激烈的今天,对药品的国际
及国内标准要进行综合分析而拟定,研发者、生产者及标准审定机构既要遵从科学
的原则,又要结合国际需求的原则,对药品的质量尽可能采取全面、深入而又不重复,并切实可行的检测控制手段,制定符合国际流通需求的基因重组蛋白药品质量标准,
以使产品在国际市场上占据一席之地。
参考文献
[1]European Pharmacopoeia 6.3.Strasbourg:European Directorate for the Quality of Medicines,4142~4144.
[2]《中国药典》2005年版(三部).北京:北京工业出版社,2005:234~235.
[3]《中国药典》2005年版(三部).北京:北京工业出版社,2005:附录30.。