《elisa检测技术》ppt课件
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优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺陷: 1. 运用范围较小，消费难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标志在二抗上，当抗体〔一抗〕和包被 在酶标板的抗原结合构成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，经过测定酶反响产物的颜色可以〔间接〕反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量〔见后图〕。
恒温箱
洗板机
酶标仪
ELISA的类型和方法
实验性质 实验目的
直接法 间接法 双抗夹心法 (直接夹心法) 双夹心法 (间接夹心法) BAS-ELISA 竞争法ELISA
半定量ELISA实验
定量ELISA实验
直接法ELISA
直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合构成酶标抗原-抗体复合物，参与酶反响底物， 测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 〔见后图〕 。该方法可用于检测抗体或抗原。
ELISA的开展概略
自从Engvall和Perlman〔瑞典，1971〕初次报道建立酶联免 疫吸附实验〔ELISA〕以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于规范化等优点，使其得到迅速的开展和广泛运用 。
随着生物技术的快速开展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的运用，使 ELISA更为简便适用和规范化，从而使其成为最广泛运用的检 测方法之一。
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色〔492nm检
测〕； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条
件反下响变 终为 止液：HCl或H2SO4溶液。 黄色〔450nm检测〕。
E
E
E
E
E
E
酶标志物
对 照 孔
参考液(不含抗原) 酶标志物
测 定 孔
样本(含抗原)
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
底物溶液 底物溶液
E
E
竞争法ELISA实验原理
半定量ELISA实验
间接法检测血清HBsAb含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳)
37℃, 30min 洗涤3次，拍干
加板 (阴、阳、样)
37℃, 30min
碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)
常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对
硝基酚 〔405nm检测〕；
2. 发荧光底物〔磷酸4-甲基伞酮〕，可用于荧 光反测 响定 终， 止灵 液敏 ：度Na高O于H 显溶色液底。物的方法。
ELISA所需仪器设备
该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细 菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。
优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便，价钱廉价。
双夹心法ELISA
双夹心法是先将未标志的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗 原，然后用未标志的抗体与抗原反响构成抗体-抗原-未标志抗体 复合物；再运用酶标二抗和抗体-抗原-未标志抗体复合物结合， 构成抗体-抗原-未标志抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法 〔见后图〕。
该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。
优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。
缺陷: 实验操作较复杂。
BAS-ELISA
BAS-ELISA即生物素-亲和素系统〔biotin avidin system, BAS〕ELISA法：是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原， 然后用生物素〔biotin〕标志的抗体与抗原反响构成抗体-抗原-生 物素标志抗体复合物，再依次参与亲和素、酶标志生物素〔或直 接参与酶标志的亲和素〕，最后加底物显色。
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能〔特点〕。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA〔生物素〕检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中参与知浓度的系列规范品溶液和 酶标志物〔酶标抗原〕；在测定孔中同时参与酶标抗原和待检样 本〔抗原〕，酶标抗原和样品相互竞争包被抗体的结合点，构成 酶标志的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗原 经过洗涤去除，参与底物后，复合物上的酶催化底物生成有色产 物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗原 结合，参与底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原 和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越高， 阐明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一定的 条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分光光 度计进展测定，从而计算出参与反响的抗原和抗体的量，从而进 一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制规范曲线 (空孔调零)
从规范曲线上 读取样品含量
ELISA实验中的本卷须知
必需设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制实验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，防止假阳性；
半定量〔或定性〕ELISA中结果判别根据通常为： OD样/OD阴≥2.1时为阳性结果，＜2.1时为阴性； 定量ELISA中每一批次的试剂盒必需绘制一个规范曲线； 定量ELISA中还应特别留意试剂盒的灵敏度(测定范围)。
ELISA实验的运用
抗体及抗体亚类检测〔包括血清、制备的抗体溶液等〕 抗原检测〔包括制备的抗原、毒素、病原体等〕； 细胞因子及其受体检测〔人、小鼠、大鼠等来源〕； 激素及其他生物活性分子检测〔如HCG检测等〕； BAS-ELISA还可用于核酸〔DNA/RNA〕检测；
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果断定 (空孔调零)
双规范)
加板 (阴、阳、规范、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
ELISA试剂盒的组成
完好的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： 〔1〕已包被抗原或抗体的固相载体〔俗称酶标板〕； 〔2〕酶标志的抗原或抗体〔酶标志物〕； 〔3〕酶的底物； 〔4〕参考规范品〔定量试剂盒〕及其稀释液； 〔5〕酶标志物及样本的稀释液； 〔6〕洗涤液〔通常为浓缩液，用前按比例稀释〕； 〔7〕反响终止液； 〔8〕封口膜假设干、阐明书一份。
目前，ELISA检测技术在科学研讨、疾病诊断、检验检疫、 环境监测等诸多领域广泛运用。
ELISA的根本原理
根本原理
酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改动抗 体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标志抗体可 与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶 液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的复原型变成 有色的氧化型，出现颜色反响。因此，可经过底物的颜色反响来 断定有无相应的免疫反响，颜色反响的深浅与标本中相应抗体或 抗原的量呈正比。此种显色反响可经过分光光度计进展定量测定， 这样就将酶化学反响的敏感性和抗原抗体反响的特异性结合起来， 使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方 法。
优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价钱廉价。
双抗夹心法ELISA
双抗夹心法是先将未标志的抗体包被在酶标板上，用于捕获 抗原，在用酶标的抗体与抗原反响构成抗体-抗原-酶标抗体复合 物，参与酶反响底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量， 本方法也称为直接夹心法〔见后图〕 。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
ELISA技术简介 ELISA的根本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法本卷须知和运用
酶联免疫吸附实验〔ELISA〕
酶联免疫吸附实验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ：
基于抗原-抗体反响的特异性和等比例性，是酶免疫测定技 术中运用最广的技术。其根本方法是将知的抗原或抗体吸附 〔包被〕在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反响板，也称酶标板 ) 外 表，使酶标志的抗原抗体反响在固相外表进展，用洗涤法将液 相中的游离成分洗除，参与相应的酶底物后发生颜色反响，经 过底物的颜色反响来断定有无相应的免疫反响，经过颜色反响 的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。
缺陷: 1. 运用范围较小，消费难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标志在二抗上，当抗体〔一抗〕和包被 在酶标板的抗原结合构成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，经过测定酶反响产物的颜色可以〔间接〕反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量〔见后图〕。
恒温箱
洗板机
酶标仪
ELISA的类型和方法
实验性质 实验目的
直接法 间接法 双抗夹心法 (直接夹心法) 双夹心法 (间接夹心法) BAS-ELISA 竞争法ELISA
半定量ELISA实验
定量ELISA实验
直接法ELISA
直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合构成酶标抗原-抗体复合物，参与酶反响底物， 测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 〔见后图〕 。该方法可用于检测抗体或抗原。
ELISA的开展概略
自从Engvall和Perlman〔瑞典，1971〕初次报道建立酶联免 疫吸附实验〔ELISA〕以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于规范化等优点，使其得到迅速的开展和广泛运用 。
随着生物技术的快速开展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的运用，使 ELISA更为简便适用和规范化，从而使其成为最广泛运用的检 测方法之一。
酶标板
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
常用底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色〔492nm检
测〕； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝色，酸性条
件反下响变 终为 止液：HCl或H2SO4溶液。 黄色〔450nm检测〕。
E
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酶标志物
对 照 孔
参考液(不含抗原) 酶标志物
测 定 孔
样本(含抗原)
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底物溶液 底物溶液
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竞争法ELISA实验原理
半定量ELISA实验
间接法检测血清HBsAb含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳)
37℃, 30min 洗涤3次，拍干
加板 (阴、阳、样)
37℃, 30min
碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)
常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对
硝基酚 〔405nm检测〕；
2. 发荧光底物〔磷酸4-甲基伞酮〕，可用于荧 光反测 响定 终， 止灵 液敏 ：度Na高O于H 显溶色液底。物的方法。
ELISA所需仪器设备
该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细 菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。
优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便，价钱廉价。
双夹心法ELISA
双夹心法是先将未标志的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗 原，然后用未标志的抗体与抗原反响构成抗体-抗原-未标志抗体 复合物；再运用酶标二抗和抗体-抗原-未标志抗体复合物结合， 构成抗体-抗原-未标志抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法 〔见后图〕。
该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。
优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。
缺陷: 实验操作较复杂。
BAS-ELISA
BAS-ELISA即生物素-亲和素系统〔biotin avidin system, BAS〕ELISA法：是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原， 然后用生物素〔biotin〕标志的抗体与抗原反响构成抗体-抗原-生 物素标志抗体复合物，再依次参与亲和素、酶标志生物素〔或直 接参与酶标志的亲和素〕，最后加底物显色。
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能〔特点〕。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA〔生物素〕检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中参与知浓度的系列规范品溶液和 酶标志物〔酶标抗原〕；在测定孔中同时参与酶标抗原和待检样 本〔抗原〕，酶标抗原和样品相互竞争包被抗体的结合点，构成 酶标志的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗原 经过洗涤去除，参与底物后，复合物上的酶催化底物生成有色产 物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗原 结合，参与底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原 和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越高， 阐明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一定的 条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分光光 度计进展测定，从而计算出参与反响的抗原和抗体的量，从而进 一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制规范曲线 (空孔调零)
从规范曲线上 读取样品含量
ELISA实验中的本卷须知
必需设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制实验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，防止假阳性；
半定量〔或定性〕ELISA中结果判别根据通常为： OD样/OD阴≥2.1时为阳性结果，＜2.1时为阴性； 定量ELISA中每一批次的试剂盒必需绘制一个规范曲线； 定量ELISA中还应特别留意试剂盒的灵敏度(测定范围)。
ELISA实验的运用
抗体及抗体亚类检测〔包括血清、制备的抗体溶液等〕 抗原检测〔包括制备的抗原、毒素、病原体等〕； 细胞因子及其受体检测〔人、小鼠、大鼠等来源〕； 激素及其他生物活性分子检测〔如HCG检测等〕； BAS-ELISA还可用于核酸〔DNA/RNA〕检测；
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果断定 (空孔调零)
双规范)
加板 (阴、阳、规范、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
ELISA试剂盒的组成
完好的ELISA试剂盒通常包含以下各组分： 〔1〕已包被抗原或抗体的固相载体〔俗称酶标板〕； 〔2〕酶标志的抗原或抗体〔酶标志物〕； 〔3〕酶的底物； 〔4〕参考规范品〔定量试剂盒〕及其稀释液； 〔5〕酶标志物及样本的稀释液； 〔6〕洗涤液〔通常为浓缩液，用前按比例稀释〕； 〔7〕反响终止液； 〔8〕封口膜假设干、阐明书一份。
目前，ELISA检测技术在科学研讨、疾病诊断、检验检疫、 环境监测等诸多领域广泛运用。
ELISA的根本原理
根本原理
酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改动抗 体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标志抗体可 与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶 液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的复原型变成 有色的氧化型，出现颜色反响。因此，可经过底物的颜色反响来 断定有无相应的免疫反响，颜色反响的深浅与标本中相应抗体或 抗原的量呈正比。此种显色反响可经过分光光度计进展定量测定， 这样就将酶化学反响的敏感性和抗原抗体反响的特异性结合起来， 使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方 法。
优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价钱廉价。
双抗夹心法ELISA
双抗夹心法是先将未标志的抗体包被在酶标板上，用于捕获 抗原，在用酶标的抗体与抗原反响构成抗体-抗原-酶标抗体复合 物，参与酶反响底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量， 本方法也称为直接夹心法〔见后图〕 。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
ELISA技术简介 ELISA的根本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法本卷须知和运用
酶联免疫吸附实验〔ELISA〕
酶联免疫吸附实验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ：
基于抗原-抗体反响的特异性和等比例性，是酶免疫测定技 术中运用最广的技术。其根本方法是将知的抗原或抗体吸附 〔包被〕在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反响板，也称酶标板 ) 外 表，使酶标志的抗原抗体反响在固相外表进展，用洗涤法将液 相中的游离成分洗除，参与相应的酶底物后发生颜色反响，经 过底物的颜色反响来断定有无相应的免疫反响，经过颜色反响 的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。