RNAi的原理和应用

RNAi的原理和应用
摘要：RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。

在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶，称为Dicer.) 作用下加工裂解形成21～25 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA。

果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物。

siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC。

关键词：RNA干扰siRNA miRNA 抑制机制
Principle and application of RNAi
Wang Chunrong
Sichuan Normal University.
Abstract: RNA interference(RNA interference,RNAi)is a defense mechanism of evolutionary
conserved against transgenic or alienvirus invasion.The endonucl ease(one with RNase Ⅲlike activity of nuclease,referred to as Dicer.)processing fracture formed under the action of21~ 25
NT(nucleotide)composed of sense and antisense sequences
of small interfering dsRNA,namely siRNA.RNase III like nucleic acid enzyme Dicer in Drosophilacontains helicase(helicase)activity and dsRNA binding domainand PAZ domain.Have been found
in mammals there are Dicer analogues.SiRNA and specific enzyme combined with the formation of RNA induced silencing
complex RISC.
Keywords: siRNA miRNA RNA interference suppressionmechanism
目录
第一章对RNA干扰的基本认识 (1)
1.1 RNA干扰提要 (1)
1.2RNA干扰的发现 (1)
第二章作用机制 (2)
2.1RNA干扰的作用机制 (2)
2.2RNA干扰的分子抑制机制 (3)
2.2.1 转录抑制 (3)
2. 2.2 转录后抑制 (3)
2.2.3 翻译抑制 (3)
第三章RNA干扰的作用 (4)
第四章RNA干扰的应用 (4)
参考文献 (6)
致谢 (6)
正文：
第一章对RNA干扰的基本认识
1.1 RNA干扰提要
RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。

将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制
( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。

RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。

RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。

在肿瘤研究中，通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。

该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。

癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。

利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。

1.2RNA干扰的发现
RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。

约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达[5]。

1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达[6]。

1995年，Guo和Kemphues 在线虫中也发现了RNA干扰现象[7]。

1998年，安德鲁·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果[1]。

从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。

并且将这种现象命名为RNA干扰。

2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。

第二章作用机制
2.1RNA干扰的作用机制
RNAi 的第一步是：dsRNA（双链RNA）在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶，称为Dicer.) 作用下加工裂解形成21～25 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA。

果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物.
RNAi 的第二步是：siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RI SC(由siRNA 中的反义链指导形成)，RISC复合物中含siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶\同源RNA 链搜索活性等，其中的siRNA解链成为单链，由其中的反义链识别与其同源的靶mRNA，并与靶mRNA配对结合，在mRNA 的近中点位置将靶mRNA切割，并由RISC中的酶把靶mRNA降解，从而阻断了mRNA传递遗传信息的功能。

siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRN A 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可
见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征.（在植物和线虫中存在的信号放大过程，但是在哺乳动物中不存在这种现象,可能与在哺乳动物体中siRNA 不能作为RdR的引物有关。

）
此外，：解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板，(RNA dependentRNA polymerases，RdRPs，又称作RDRs)的作用下形成新的dsRNA，并再次被Dicer识别并切断后形成新的siRNA，这
种新产生的siRNA(次级siRNA,secondary siRNA)又可形成更多的RISC复合物并作用于mRNA，使mRNA降解。

因此小剂量的dsRNA即可诱导强大的PTGS，即PTGS具有类似于激素作用或PCR那样的级联放大效应。

最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体; 随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与. 此外,ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子
2.2RNA干扰的分子抑制机制
2.2.1 转录抑制
与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。

这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。

这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。

2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应D NA区域从头合成DNA的甲基化。

Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。

2. 2.2 转录后抑制
不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。

这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。

siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个b p不配对，就不能产生RNAi。

2.2.3 翻译抑制
Grishok等[8]在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。

这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。

ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成s tRNA，由stRNA抑制翻译。

这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引起RNA干扰现象。

microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结构。

microR NA产生于该茎环结构的双链区。

其特点与siRNA基本上相同[14]。

miRNA 与s iRNA 的区别：
（1）miRNA是单链的，而siRNA则是双链的；
（2）miRNA参与正常情况下生长发育基因调控，而siRNA不参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA,作为miRNA的完善和补充；
（3）miRNA在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而siRN A为转录后水平调节基因表达调控；
（4）Dicer酶对两类RNA的加工过程，miRNA为不对称性，仅来自含茎－环结构RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而这种不对称性不存在于而siR NA加工过程中。

第三章RNA干扰的作用
2001年，Tuschl等将siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。

RNAi机制普遍存在于动植物，尤其是低等生物中。

因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。

一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。

在病毒自身基因组所包含的，或在病毒复制过程中产生的双链RNA可以被Dicer识别，从而引起病毒RNA降解。

但是许多病毒为抵抗宿主的RNA干扰机制，会产生抑制宿主RNA干扰的蛋白，以保护病毒基因在宿主体内的顺利复制。

已经发现的可以抑制宿主RNA干扰的病毒蛋白有potyviruses编码的HC-PRO蛋白、马铃薯X病毒编码的Cmv2b蛋白、兽棚病毒编码的B2蛋白等[9]。

RNA干扰也是抑制破坏基因结构的一种DNA片段转录子活性的重要方式。

转录子通常以逆转录的方式在基因组中扩增。

在逆转录过程中产生的双链RNA 分子可以被Dicer识别，从而被降解。

目前发现，RNAi机制中的相关一些因子如内源性双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS（post transcri ptional gene silencing），如RNAi机制同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。

第四章RNA干扰的应用
RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。

大多数药物属于标靶基因（或疾病基因）的抑制剂，因此RNAi 模拟了药物的作用，这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势。

因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。

同时，那些
在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。

在药物标靶发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。

生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。

如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。

一旦所发现的基因属于可用药的靶标（如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外），就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。

此外，被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。

在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。

在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法。

肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。

参考文献
[1] Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998, 391(6669): 806–11.
[2]Winston, William M. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science. 2002.March, 295: 2456.
[3]Jae-Yean, Kim. Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Current Opinion in Plant Biology. 2005.February, 8: 45.
[4] Matzke MA, Matzke AJM. Planting the Seeds of a New Paradigm.. PLoS Biol. 2004, 2 (5): e133. PMID 15138502.
[5]C, Napoli C; Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 1990, 2 (4):
279–289 [2007-07-09]. PMID 12354959.
[6] Macino G, Romano N. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol. 1992, 6 (22): 3343–3353. PMID 1484489.
[7]Kemphues KJ, Guo S. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995, 81 (4): 611–620. PMID 7758115.
[8]Grishok A,Pasuinelli AE,Conte D et al.Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temperal RNA that control C. elegans developmental timing [J]Cell,2001,1065(1):4557-4565
[9] Ding SW, Li WX. Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechnol. 2001, 12 (2): 150–4. PMID 11287229.
致谢：
已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。

线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。

与传统的基因敲除技术相
比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。

感谢科学家的努力，让我们的知识得到完善与发展。