中国特有植物血水草RAPD反应体系的优化

Abstract In order to establish th e opti m al reaction of RAPD PCR am plificat io n for E om econ chionantha H ance , 2+ th e follow in g param eters w ere opt i m ized : th e concentra tio ns of M g , tem plate DNA, d NTPs, pri m ers and Taq DNA po lym erase . T he opti m a l RAPD PCR react io n system w as as fo llow s a total vo lum e of 25 L conta in s 2 . 5 - 1 2+ - 1 L 10 Buffer , 1 . 8 mm o l! L M g , 2U T aq DNA po lym erase , 50 ng temp late DNA, 0 . 2mm ol! L dNTP s -1 and 1 . 6 mo l! L pri m er . The reaction program fitt ing to the RAPD PCR w as as fo llow s : in it ial denaturation at 94 ∀ for 2 m in, fo llow ed by 5 beforehand cyc les of 94∀ for 20 s , 36∀ for 30 s, 72 ∀ for 75 s; fo llow ed by 40 cyc les o f 94∀ for 20 s , 40∀ for 30 s, 72∀ for 60 s , and a fina l exposure to 72 ∀ for 20 m in , then stored in 4∀ . T h isRAPD PCR syste m has som e d is tin gu ising featu res inc lud ing clear m arker site , stable reaction system, re liable abundant polym orphism s , and better repeatability. It is suitable fo r the study on genetic diversity of E. ch ionantha. K ey w ord s RAPD; reaction syste m; opt i m izatio n ; Eom econ chionantha H ance RAPD( Random Amp lified Po lym orphic DNA )技 术是 20 世纪 90 年代初由 W illia m s和 W elsh 两个 研究小组几乎同时建立的检测随机扩增多态 DNA [ 1] 的分子生物学技术 。 RAPD 分子标记技术具有 周期短、 费用低、 多态性较高、 灵敏度高、 无辐射危 险等特点, 而且它能更全面地反映基因组的变异情 况, 是一种较理想的分子标记方法。目前, 该项技 术已广泛应用于种下水平遗传多样性的检测、 探讨 种间或属间的遗传关系、 种质资源鉴定与分类、 遗 传图谱的构建、 基因定位与分离、 突变体的鉴定及 育种材料等方面
1
JU Jian W en
1
GUO Yong Jiu
528222)
1
( 1. College of Life Science, Jinggangshan U n iversity, J i# an
343009 ; 2 . Foshan In stitu te of Forestry S cience , Foshan
摘
要
为建立血水草的 RAPD PCR 最佳反应 体系 , 对影 响血水草 RA PD 反应 的 M g2+ 、 模 板 DNA、 dNTP s 、 引物浓
度和 T aq 聚合酶用量等因素进行优化。结果表明 : 25 L 反应体系中含 10 Buffer 2. 5 L, 1. 8mm o l ! L- 1 M g2+ , 2U TaqDNA 聚合酶 , 50 ng 模板 , 0 . 2 mm o l! L- 1 dNT Ps, 1. 6 m ol! L- 1 引物。扩增 程序为 : 94∀ 预变性 2m in; 预扩增 : 94∀ 变性 20 s , 36∀ 退火 30 s , 72∀ 延伸 75 s , 5 个循环 ; 扩增 : 94∀ 变性 20 s , 40∀ 退火 30 s , 72∀ 延伸 60 s , 40 个循环 ; 72∀ 保温 20 m in, 4∀ 保存。所建立的血水草 RA PD PCR 反应 体系具有 标记位 点清晰、 反 应系统 稳定、 检测多 态性 能力强、 重复性好等特点 , 可以较好地 应用于血水草的遗传多样性分析研究。 关键词 RA PD; 反应体系 ; 优化 ; 血水草 文献标识码 : A 文章编号 : 1673- 5102( 2011) 01- 0089- 06 中图分类号 : S567 . 23
346
20
荆竹山 Jingzhu shan 梨坪 L ip ing 水口 Shu ikou
灌丛 Shrubs 针阔混交 Con ifer and b road leaved forest 杉木林 F ir forest
783
18
900
18
908
16
2 方法
2 . 1 DNA 提取 待幼苗成活且生长良好时 , 在每个植株上摘取 茎尖端的幼叶 0 . 1g , 采用改良后的 CTAB 法提取 [ 15 ] 血水草的基因组 DNA , 采用琼脂糖凝胶电泳法 检测基因组 DNA 纯度和浓度。 2 . 2 引物筛选 用购自上海生工 ( Sangon 公司 ) 50 条聚寡核苷 酸随机引物筛选出 16 条产物稳定、 反应性强的引 物 ( 表 2)。
[ 2~ 6]
。但是 RAPD PCR 易受到试
验条件的影响 , 结果的重现性不高。因此, 建立精
基金项目 : 国家自然科学基金 ( 30560025) ; 江西省教育厅科学技术研究项目 ( G JJ09660) ; 井冈山生态 环境研究中心 开放基金项目 ( EE R C0501 ) ; 教育部新世纪优秀人才支持计划 ( N CET - 07- 0385) 第一作者简介 : 胡雪华 ( 1977 ) , 女 , 硕士 , 实验师, 从事植物资源及植物生理生态学的教学与科研工作。 * 通讯作者 : E m ai: l iyanx iao @ yahoo. com. cn 收稿日期 : 2010- 03- 04
。血水草 生长于荫凉潮 湿的生态环境 中, 全
草入药, 具有清 热解毒、 活血止血之效 , 外用治湿 疹、 疮疖、 无名肿毒、 跌打损伤, 内服治劳伤腰痛、 肺 结核、 咳血 等症
[ 9]
。目 前有关血水草 的研究国外
未见报道, 国内的研究也仅限于化学成分、 药理活 性及检测、 主要成分的抑菌、 杀钉螺效果、 解剖学特 [ 9~ 14 ] 征以及血水草生活的生态环境等方面 。作为 一种野生中药材和观赏植物, 血水草的资源有限, 而该物种野外资源已经存在逐步缩小的趋势, 因此 探讨血水草遗传多样性对该物种的保护、 开发和利
Optim ization of RAPD R eaction Syste m for Eom econ chionantha Hance, an Endem ic H erbaceous of China
HU Xue H ua
1
CHEN X iang
2
XIAO Y i An
1*
LI AO X in Jun
植物研究 2011, 31( 1): 89~ 94 Bu lletin of Botan ical R esearch
中国特有植物血水草 RAPD 反应体系的优化
胡雪华
1
陈
香
2
肖宜安
1 *
廖信军
1
鞠建文
1
ห้องสมุดไป่ตู้郭永久
528222 )
1
(1 . 井冈山大学生命科学学院 , 吉安
343009; 2 . 广东省佛山市林业科学研究所 , 佛山
[ 8] [ 7]
用极为重要和迫切。本试验通过严格控制反应条 件和设置重复建立血水草的 RAPD PCR 最佳反应 体系 , 为深入开展血水草遗传多样性分析和种质资 源保护等研究提供理论基础和技术保证。
, 西北 秦岭也有分
1 材料
根据血水草在井冈山实际的分布情况, 按其分 布海拔、 生境条件、 空间分布以及林分特征选择 5 个种群用于遗传多样性研究 ( 表 1) 。采样时, 选定 一个株群为中心 , 在距中心 10m 左右的距离上 , 分 4个不 同的方 向各选择 一个株群 随机采 样 4 ~ 5 株, 共选择 4 个 ∃ + %形采样点, 各种群选取 16~ 20 个植株。采样时 , 为避免采集到的个体出自同一克 隆植株, 我们同时还将个体根茎挖开, 以确保每个 样本都是独立的个体。将相应个体标记后移植至 井冈山大学科研基地 , 50 % 遮荫网下种植培养。
生境 H ab itat 海拔 A ltitud e( m ) 845 采样量 ( 个 ) Total of sam ples 18
人工竹林 , 郁闭度大 , 光照较弱 , 湿度大 B amboo p lan tat ion s , h igh coverage , less light , h igh relat ive hum id ity 群落垂直结构复杂 , 郁闭度较高 , 光照较弱 , 气候湿润 Com p licated in vertical structu re, h igh coverage , less light , h igh relat ive hu m id ity 灌丛冠层 , 光照好 , 生长状态好 , 血水草为优势种 Shrub s layer , good ligh t cond ition , good grow th cond ition , E. ch ionantha is dom inant species 群落简单 , 光照适宜 , 物种单一 Si m ple in vertical st r u cture , good ligh t cond ition , less species 光照适宜 , 土层较厚 G ood light cond ition , th ick soil
90
植
物
研
究
31 卷
确的 RAPD 反应体系对保证 RAPD 试验的准确可 靠非常重要。 血水草 ( Eom econ chionan th a H ance) 为罂粟科 ( P apaveraceae)血水草属 ( Eom econ ) 多年生草本植 物 , 是我国单属单种的特有植物。血水草特产我国 长江以南各省区和西南山区 布
表 2 RAPD 引物序号及序列 Table 2 RAPD pr i m ers and the ir sequences
引物编号 Pri m er S90 S1 S82 S103 S117 S119 S62 S7 序列 5& 3& Sequ ence AGG G CC GTCT GTT TCG CTCC GG C A CT GAG G AGA CGT CCA C CAC TCT CCTC CTG ACC AG CC GTG AGG CGTC GG T GAC G CA G 引物编号 Pri m er S43 S27 S1351 S30 S17 S10 S5 S65 序列 5& 3&
表 1 Tab le 1
种群 Popu lat ion 茨坪 C iping 黄坳 Huang# ao 群落类型 Commun ity type 竹林 B amboo forest 常绿阔叶林 Evergreen broad leaved forest
5 个样地的生境参数
Param eters for Five hab itats of E. ch ionan tha